流式细胞仪在睡眠性阵发性血红蛋白尿的诊断中的应用
一.睡眠性阵发性血红蛋白尿PNH
睡眠性阵发性血红蛋白尿（PNH）是一种获得性造血干细胞异常，临床主要表现为骨髓丧失造血功能、血栓、慢性溶血性贫血急性发作。PNH的发病率很低，发病原因不详，可能与再生障碍性贫血有关系。PNH的临床表现不一，疾病进程多变，给临床的诊断治疗和疾病研究带来很多困难。最近15年，在PNH的细胞和分子生物学研究中取得了重要进展，定义了导致PNH异常表现的分子缺陷。而使用流式细胞仪进行PNH诊断分型，是PNH研究的又一里程碑。
（一）历史回顾
Strubing早在一个世纪之前，就第一次报告了PNH，症状为溶血性贫血，伴有夜间血红蛋白尿。50年后，Ham和Dingle证明了PNH患者的红细胞在血清酸化条件下，易发生溶血，这就是现在普遍使用的Ham实验，用来诊断PNH。不久，又发现PNH的溶血是由于患者的红细胞对补体敏感。进而又发现PNH患者的中性粒细胞和血小板也有异常。Dacie在1963年提出了PNH是由于干细胞突变造成的获得性克隆异常的假说。后来，通过对两位患有PNH的妇女的异构酶葡萄糖6磷酸脱氢酶的研究，证实了这一假说。PNH红细胞中只含有一种异构酶，而病人正常红细胞中含有两种异构酶。
（二）生化缺陷
1983年，PNH红细胞的生化研究表明，PNH缺乏一种被称为延迟加速因子DAF的补体调控蛋白。这种蛋白抑制补体C3转换酶的形成，并通过glycophosphatidylinositol（GPI）的锚定作用（翻译后处理步骤）固定在细胞膜上。进一步研究表明，PNH细胞缺少这种通过GPI与细胞膜的正常连接。这意味着，GPI锚定蛋白的合成异常，是PNH的起因。PNH细胞系的GPI合成的生化通路也异常，这种异常发生在通路的第一阶段的N-acetylglucosamine到phosphatidylinositol的转移过程中。
（三）分子缺陷
1993年Miyata等发现了PHN的基因缺陷。通过对一系列复杂的补体和转染研究，证实了PNH细胞系的phosphatidylinositol glycan complementation class A（pig-a）基因表达了错误的GPI相关的抗原。对pig-a基因进行序列分析，发现迄今为止，所有报导过的PNH病人都有pig-a基因的突变。由于这种突变发生在体细胞，所以表现不一致，并且在整个pig-a编码区域中，都有发生突变的可能。这些突变包括缺失、插入和点突变。所有的缺失和插入部分都很小（只有一到二个），导致漂移突变，产生了无功能产物。漂移突变导致了细胞完全缺乏GPI锚蛋白（III类细胞）。另一部分突变是点突变，保留部分活性，可以合成少部分的GPI锚蛋白。这种突变细胞表达部分GPI锚蛋白（II类细胞）。由于pig-a基因位于X染色体，每个细胞只有一个功能性pig-a基因（女性X染色体失活），因此，单一突变会造成GPI缺失表型。相反，每个细胞中都有两个具有活性的常染色体pig基因，只有常染色体上两个等位基因都发生突变，才会产生PNH症状。
（四）流式细胞仪分析
使用分子生物学已经成功发现了PNH的基因缺陷，而使用单克隆抗体和流式细胞仪技术则是发现诊断PNH表型异常的重要手段，具有同样的重要意义。1985年，两个各自独立的小组使用流式细胞仪和DAF（CD55）抗体，调查PNH患者，发现了缺乏DAF的红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和血小板。这都证明PNH的多系特征，有力支持PHN是克隆性干细胞疾病的学说。进一步分析PNH病人骨髓造血干细胞，发现也缺乏DAF的表达。之后，随着新的GPI锚蛋白单克隆抗体的出现，PNH的研究又进一步深入。Van der Schoot等发现PNH患者中性粒细胞缺乏CD16、CD24和CD67（后来有更名为CD66b）。同时，他们第一次证明在PNH诊断中，流式细胞仪检测优于Ham实验。在研究中，他们分析了16例再生障碍性贫血的病人，在3例病人的粒细胞中发现了少量PNH克隆，而这3例病人Ham实验均阴性。后来有人又进一步证实了一些严重再生障碍性贫血的病人有GPI缺乏的粒细胞和单核细胞，而红细胞可以正常。于是，流式细胞仪诊断PNH的可靠方法很快建立起来，同时，还用来判断PNH的疾病程度和PNH克隆的造血细胞系别来源。现在，尽管目前使用的流式细胞仪检测技术在方法学和抗体选择上还没有统一，但它已经取代了Ham实验，成为了PNH诊断的“金标准”。使用流式细胞仪可以发现Ham实验阴性的再生障碍性贫血病人中存在的少量PNH细胞，这可以将PNH分为两种情况：（1）溶血性PNH，特征是显性溶血性贫血，同时有血红蛋白尿。值得注意的是，这组病人中，有50%发生静脉血栓，这是导致病人死亡的主要原因。（2）再生不良性PNH，可以检出GPI缺乏的造血细胞，没有显性溶血，但可能有其它症状，如再生障碍性贫血、白细胞减少症或血小板减少症。这组病人中，有10%死于再生障碍性贫血。
很多病人由于同时具有以上两组的症状，而不能单纯分类归于某一组。有一部分病人有再生不良性PNH，然后进展为溶血性PNH。另一小部分病人——但在临床上很重要——首先就有血栓形成，临床上却没有溶血症状。而且，发现及少数病人有先天性（非pig-a突变）GPI缺乏。一些研究小组也报导了Budd-Chiari综合症（肝静脉栓塞）病人伴有PNH高发。很明显，遇到病人血栓形成（如肝静脉和脑静脉）无法解释时，应该排除PNH的可能。
二.PNH的实验室诊断
基于红细胞补体敏感性的实验在有流式细胞术之前，PNH检查主要依靠溶血实验。Ham实验、蔗糖溶血实验和改进的Ham实验的原理是：PNH红细胞对溶血的敏感性与正常细胞不同。这些实验虽然对溶血性PNH有效，但既不能有效检测出PNH红细胞含量少的样本，也不能区分部分缺失和完全缺失的细胞。另外，由于输血原因，且PNH红细胞的寿命较短，以上这些实验都不能对PNH克隆给予准确判断。研究表明，通过流式细胞仪分析发现GPI缺乏的中性粒细胞，可以更加准确地判断PNH克隆的情况。Ross及其同事于1906年代创建了补体溶血敏感实验（CLS），这个实验可以对PNH红细胞的类型和比例给予更准确的判断。但是，CLS实验及费时费力，难于操作，不适合常规诊断。近来又改进方法，发展了DiaMed单克隆抗体胶技术，用于PNH筛查，它克服了一些CLS方法的技术难点。这一方法可以在血液病实验室常规使用，但是与流式细胞仪方法比较，其灵敏度、特异性都要差一些。而且DiaMed方法仍然需要做大量的临床实验，来验证方法的可靠性。
（一）流式细胞仪
使用流式细胞仪分析血细胞GPI锚蛋白，需要考虑设门的策略和抗体的选择。而且，对于PNH检测的结果的解释，有赖于对GPI相关抗原在细胞上的分布和在造血细胞分化的不同阶段有不同表达（见下表）的相关知识的了解。用流式细胞仪检测PNH，并不是说在PNH细胞上，所有的诊断用抗原全都不表达。因此，应该所有细胞类型上筛查至少两种GPI抗原，以排除先天性单一抗原缺乏的可能，同时排除技术原因造成的误差。另外，应该使用跨膜抗原检测做为阳性对照。
1.红细胞分析：早期的研究检测集中在红细胞GPI相关抗原的表达上。原因有二。第一，疾病主要的临床症状是溶血。第二，以往的PNH筛查实验，如Ham实验和蔗糖溶血实验，是红细胞检查。PNH以前属于于获得性溶血性贫血，但是现在发现是属于干细胞异常。尽管目前还没有一致的设门策略，我们倾向于前向角散射光（FSC）和侧向角散射光（SSC）使用对数放大模式，并根据红细胞的物理特性，FSC/SSC设门。同时，检测一个已知在所有红细胞上都表达的非GPI相关的糖蛋白抗原，计算阳性百分率，用来判断FSC/SSC设门的纯度。与分析淋巴细胞、白细胞或干细胞的Boolean设门策略相比，这种设门方法不够理想。在做红细胞多色分析时，应该考虑红细胞聚集造成的影响。细胞洗液和单抗试剂中有少量蛋白成分，容易使结合了抗体的红细胞发生聚集。因此，我们选择做单色分析。
在PNH红细胞常规筛查实验中，建议使用直标抗体，检测两种GPI相关抗原——CD55和CD59。如果检测到阴性或部分缺失的细胞，一定是两种GPI相关抗原同时缺失，才可以诊断PNH。这是因为，有一些少见的遗传性缺失的病人可以缺少CD55或CD59之一。
分析未输血的PNH病人，发现细胞可以明显分为三种类型：III型细胞（完全缺失）、II型细胞（部分缺失）和I型细胞（正常表达）。不同病人的三型细胞的Mark设定可能会有所不同，有时三群细胞可能不能清楚地分开。
大多数PNH病人的粒细胞异常克隆比例大于红细胞异常克隆。这是由于与正常红细胞相比，PNH红细胞的寿命较短，且输血后，比例减少。近年来的研究表明，III型红细胞的寿命为17-60天，II型红细胞（CD59至少为正常细胞表达量的15%）可以较少产生补体介导的溶血反应。有趣的是，使用噻唑橙和CD59分析PNH患者的网织红细胞，发现PNH网织红细胞的比例与中性粒细胞克隆的比例相近。这说明，在PNH中，红细胞和中性粒细胞的骨髓前体具有相似的增殖能力，检测PNH患者的网织红细胞可以提供有关红细胞生成率的重要信息。很显然，未来的流式细胞仪检测趋势是利用物理信号和荧光信号，建立一个更加有效的红细胞设门策略。
2.粒细胞分析：以前对PNH粒细胞的研究主要是FSC/SSC设门的单色或双色研究。尽管用此方法做单抗原分析是可行的，但是只利用粒细胞的物理特征进行设门可能会导致某些误差。在许多PNH病历中，普遍认为位于粒细胞门中的中性粒细胞占绝大多数。但是，有时也会存在有相当数量的嗜碱性粒细胞。在使用CD16单色分析含量较少的粒细胞PNH克隆时，误差就暴露了，因为中性粒细胞CD16+，但正常嗜碱性粒细胞CD16-。FSC/SSC设门的另一个问题是，骨髓增生异常综合症时，会有许多无颗粒中性粒细胞，这时，只使用物理特征就无法设定粒细胞门了，这时必须使用系列标志/SSC设门。
最好使用三色分析检测PNH粒细胞。检测时，应该保证在操作过程中减少细胞丢失，同时使用SSC/非GPI相关蛋白的系列抗原（如CD15、CD33、CD45）设定粒细胞门，另外两个荧光通道用来检测GPI相关抗原。染色方法不完全一样，如先染色后溶血，或先溶血后染色。先染色CD55、CD59时，比较难建立正确的抗体滴度，因为要同时染红细胞和其它血细胞。使用氯化铵或其他溶血素先溶血的样本，CD55和CD59抗体的滴度容易确定。CD16、CD24、CD66也是如此。同时使用CD16和CD66可以很清楚地区分出中性粒细胞和嗜碱性粒细胞。
红细胞可以在4C条件下保存25天，仍可以做实验，而粒细胞分析则必须在样本采集后几小时内进行。CD59是分辨I型、II型、III型细胞的最好标志。但是，粒细胞的区分程度不如红细胞明显，而在许多PNH中性粒细胞上，CD16表达很弱。粒细胞在体外环境中放置，随着细胞存活率的下降，细胞的非特异染色增强，自发荧光增强。虽然阴性同型对照在PNH检测中不是必须的，但是，这对于分析粒细胞，尤其是陈旧样本来讲，是非常重要的。对于大多数PNH病例来讲，样本中残留的少数正常中性粒细胞可以作为GPI缺失的PNH克隆的内参对照。另外，需要注意的是，在一些病例中，粒细胞和红细胞GPI表型不一致，粒细胞部分缺失，而红细胞完全缺失或者是II型细胞和III型细胞的混合表型。
3.单核细胞分析：有一些研究小组分析了PNH病人的外周血单核细胞，发现散射光门内的PNH单核细胞缺少CD14、CD55、CD59或CD48。其中CD14和CD55是比较多见的检测抗体。由于细胞起源相同，PNH单核细胞克隆和PNH粒细胞克隆的一致性很好。但是，Alfinito等报告，与PNH粒细胞相比，CD14-的单核细胞比例较高。而且，CD14+单核细胞（正常细胞）的百分含量与血红蛋白和血小板含量正相关，而且CD14+细胞<10%的病人有活动期症状。检测GPI相关抗原部分缺失的单核细胞很困难，只有CD48可以有中间状态的染色。由于PNH病人的单核细胞的数量通常都比较低，在检测时很难获取到足够量的单核细胞。做PNH单核细胞分析时，可以使用系列标记/SSC设门。由于CD14是GPI锚抗原，所以不能用于设门；CD64（FcRI）、CD33和CD4可以用来设门。在多色分析时，可以使用CD14 dim/SSC low或CD33 bright/ SSC low设定单核细胞门，然后分析门内细胞的CD14、CD55、CD59和CD52的表达。使用这种方法，可以清楚地分析出单核细胞PNH克隆的CD14表达缺失。分析表明，单核细胞PNH克隆与粒细胞PHN克隆相近。
4.淋巴细胞分析：使用流式细胞仪多色分析，发现很多PNH病人有缺乏GPI的淋巴细胞，尤其是病程较长的病人。与粒细胞PNH克隆相比，PNH T、B、NK细胞一般含量很少。这可能是因为PNH发病前就生成的正常T、B淋巴细胞的寿命较长。在诊断PNH时，不建议只检测淋巴细胞上GPI相关蛋白的表达。在正常T淋巴细胞中，CD55和CD59的表达水平不一致。使用CD48，可以明显区分正常细胞和PNH T、B、NK细胞。
5.血小板分析：PNH病人多发生血栓，是主要的致死原因。GPI锚蛋白与血管内溶血无疑是相关联的，但目前仍没有一个好的机理可以解释这种关系。而且，也不清楚为什么在某些解剖部位（如腹内和/或肝静脉）多发生血栓。当前主要研究血小板缺乏GPI-anchored urokinase plasminogen activator receptor（Upar，CD87）和其它GPI相关补体调节蛋白（CD55或CD59）是一种可能原因。此溶血/血栓形成过程的生化性质还不是很清楚。
同红细胞和粒细胞分析一样，文献报导中，PNH血小板分析没有获得一致意见，研究只限于在富血小板血浆（PRP）中加入或不加入某些试剂，抑制血小板活化。
少数一些人研究了PNH病人血小板的CD55和CD59的表达。这些研究主要使用FSC/SSC设门，同时使用非GPI相关蛋白的抗体（CD42b或CD61）评估设门效果。正常血小板的CD59和CD55的表达比较弱，正常血小板中约有10%不表达CD59和CD55。这种表达缺失，是真性的，还是由于技术限制造成的，目前还不清楚。因此，PNH病人检测GPI缺乏的血小板不容易分辨，II型细胞与III型细胞也很难区分。有报导说去除PRP中的红细胞可以提高实验的灵敏度。Maciejewski等做双色分析，使用CD42a和CD42b辨认血小板，并分析了正常血小板和PNH血小板的CD55和CD59。样本放置保存，观察5天，发现两种GPI相关抗原的水平均下降。结果表明，大多数PNH病人都可以检测到GPI缺失的血小板。检测PNH病人血小板的诊断用途和临床关系目前还没有明确结论。可以推测，PNH血小板的含量可能与PNH巨核细胞的含量高度相关。另外，PNH病人血栓高发也是未来的研究重点。
（二）流式细胞仪：分析实验的几点建议
外周血是PNH免疫表型分析的最佳样本。要求做检测的病人提供近期输血记录。建议对红细胞和粒细胞都做筛查。原因如下：
1. 少数病人（5%）只有粒细胞PNH克隆。
2. 严重溶血期后，GPI缺乏的红细胞可能会极度减少，甚至可能下降到检测限以下。而且，如果病人在检测前有多次输血，那么，PNH筛查可能受到输入血的影响，导致错误结果。
3. 病人如果有严重的再生障碍性贫血，可能导致粒细胞数量减低，不够检测分析。
红细胞检测时，至少两种GPI相关抗原（CD55、CD59、CD16、CD24或CD66）缺失，才能诊断PNH，在一些罕见的遗传条件下，可以有单一抗原缺失。红细胞分析中，I型细胞、II型细胞和III型细胞的分辨效果最清楚。分析外周血粒细胞时，建议使用系列标记（非GPI锚蛋白）/SSC设门的方法，当然，在多数病例中，FSC/SSC设门也是可以接受的。
（三）PNH病人的临床管理
PNH的特征是血管内溶血、血细胞减少、骨髓造血功能障碍、易于发生静脉血栓。PNH是一种中等存活率（10-15年）的慢性疾病。最常见的并发症和致死原因是静脉血栓（部分影响肝静脉）和进行性骨髓造血功能障碍。PNH唯一可能的治疗方案是异体骨髓移植（BMT）。但是，只有少数病人适合做BMT。对于大部分PNH患者来说，BMT的风险太高。PNH保守治疗可以缓解许多疾病症状，预防并发症。
虽然PNH病情严重，但大部分病人可以存活。大约有1/4的病人存活期超过25年，有约15%的病人病情自然缓解。现在还没有方法来判断哪些病人可以缓解，但是，初步证据显示，一系列的流式细胞仪检测可能帮助做预测。
三. 总结
使用流式细胞仪分析红细胞和粒细胞的GPI相关蛋白，是PNH筛查和诊断的灵敏、特异的方法。由于PNH发病率低，经常导致诊断的延误。回顾性研究显示，极少数诊断延误可以达15年之久。可以使用流式细胞仪做快速筛查工作，这种方法优于Ham实验。新诊断的PNH患者，需要预测临床进程，预测病人发生血栓的危险性，预防病人发展为溶血型或再生不良型。判断病人是否发生自发缓解对于决定治疗方案，尤其是是否进行BMT，是非常重要的。
使用流式细胞仪检测PNH克隆大小，这对于临床和预后的指导意义目前还不清楚。数据表明，溶血性PNH病人细胞主要是完全缺失（III型细胞）的红细胞。由于PNH粒细胞的百分含量最准确地反映了PNH克隆大小，理论上来说，病人外周血标本PNH粒细胞的系列监测是疾病活动性的最准确的指示。
