碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的分离与纯化
一、实验目的
1.掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理；
2.悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。
二、实验原理
有机溶剂分级沉淀是分离蛋白质的常用方法之一。有机溶剂能使许多溶于水的酌生物大分子发生沉淀，其主要作用是降低水溶液的介电常数。例如20℃时水的介电常数为80，82％的乙醇溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低意味着溶质分子间异性电荷库仑引力增加，从而使溶质的溶解度降低。
这一点可从静电学的库仑定律中得到阐明。同时有机溶剂溶于水，对大分子物质表面的水化膜具有破坏作用，最后使这些大分子脱水而互相聚集析出。沉淀不同物质所需有机溶剂的浓度不同，利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中发生沉淀作用而达到分离。
用于生物大分子分级分离的溶剂主要是能与水互溶的有机溶剂，常用的有乙醇、甲醇和丙酮等。
进行有机溶剂沉淀时，欲使原溶液中有机溶剂达到一定浓度，需加入有机溶剂的浓度和体积可按下式
计算：
V－需加10 0％有机溶剂剂的体积；
V0－原溶液的体积；
S1－原溶液中有机溶剂的浓度；
S2－要求达到的有机溶剂浓度；
100－指加入的有机溶剂浓度为100％。如所加入的有机溶剂的浓度为95％，上式(100一S2)项应改为(95一 S2)。
在大规模制备沉淀时，若溶剂浓度的要求不太严格时，可用简单的交叉方法求出。
本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。醋酸镁则有保护和稳定AKP
的作用。匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。根据AKP
在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP
的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。
用有机溶剂分离纯化酶(或蛋白质)必须注意以下几点：
(1)有机溶剂沉淀是个放热过程，所以要在低温下进行。溶剂应预冷，加入时要边搅拌边滴加，以避免局部浓度过高使酶蛋白变性。
(2)溶剂的pH 值最好控制在被分离物质的等电点附近，以提高被分离物质的分离效果。蛋白质浓度应控制在5-20 mg/m1，以防止高浓度样品的共沉淀作用。
(3) 溶液的离子强度控制在0.05一0.1范围内。
(4)有机溶剂中有中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性，提高分离效果。中性盐浓度一般 0.05mo1/L 左右为好，过高影响沉淀。
三、仪器、原料与试剂
仪器
移液管、量筒、玻璃勺浆器(管)、剪刀、离心机、新华定性滤纸。
原料
新鲜兔肝
试剂
1. 0.5mol/L 醋酸镁溶液：107.25g 醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至1000 m1。
2. 0.1mol/L 醋酸钠溶液：8.2g 醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000 m1
3. 0.0lmol/L 醋酸镁一0.01mol/L 酸酸钠溶液：准确吸取20mL 0.5mol/L 醋酸镁溶液及100mL0.14mol/L 醋酸钠溶液，混匀后定容至1000 m1。
4. Tris—HCl pH8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.1g，用蒸馏水溶解后定容至1000mL，即为0.1mol/LTrls
溶液。取100m10.1mol/LTrls 溶液，加蒸馏水约780mL，再加0.1mol/L 醋酸镁溶液100m1，混匀后用1％冰醋酸调pH
为8.8，用蒸馏水定容至l000m1。
5. 正丁醇、丙酮、95％乙醇均为分析纯试剂。
四、操作步骤
以下操作均在 4~10℃进行。
1.称取新鲜兔肝2g，剪碎后，置于玻璃匀浆器中，加入2.0mL0．01mol/L
醋酸镁一0.01mol/L酸酸钠溶液，充分磨成匀浆后，将匀浆液转移至离心管中，用4.0mL
上述溶液分两次冲洗匀浆管，并倒入离心管中，混匀，此为A 液。另取1支试管，编号为A，取0.1mLA 液，加4.9mLTris缓冲液掖(pH
8.8)，混匀，供测酶活性用。
2.加2.0mL 正丁醇溶液于上述剩余的匀浆液中，用玻璃棒充分搅拌2min 左右。然后在室内放置20 min 后，滤纸过滤，滤液置离心管中。
3.于滤液中加人等体积冷丙酮，立即混匀后离心5min(2000 r/min)，弃上清波，向沉淀中加入4.0mL0．5mol/L
醋酸镁溶液，用玻璃棒充分搅拌使其溶解，同时记录悬液体积，此为B掖。吸取0.1m1B 液，置于编号为B 的试管中，加入4.9m1Tris
缓冲掖(PH 8.8)，供测酶活用。
4.取剩余悬液体积，并计算使乙醇终浓度为30％需要加人的95％冷乙醇量。按计算量加入乙醇，混匀，立即离心5min(2000r/min)，量取上清液体积。倒人另一离心管中，弃去沉淀。
向上清液中加入95％冷乙醇，使乙醇终浓度达60％(计算方法同前)，混匀后立即离心5min(2500r/min)，弃上清。向沉淀中加入4．0m1 0.0lmol/L 醋酸镁一0.01mol/L 酸酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。
5.重复操作步骤4，向悬浮液中加入冷乙醇(95％)，使乙醇终浓度达30％， 混匀后立即离心5min(20 00r/min)，计算上清液体积，倒人另一离心管中，弃去沉淀，向上清液中加入95％
的冷乙醇，使乙醇终浓度达60％。混匀后，立即离心 5min(2500 r/mLn)，弃上清夜，沉淀用3mL0.5mol/L
醋酸镁溶液充分溶解，记录体积，此为C 液。吸取C 液0.2m1置于编号为c 的试管中，加入3.8m1Tris 缓冲液(PH
8.8)，供测酶活性用。
6.向上述剩余悬液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮终浓度达33％，混匀后离心5min(2000r/min)，弃去沉淀。量取上清液体积后转移至另一离心管中，再缓缓加人冷丙酮，使丙酮终浓度达
50％，混匀后立即离心15min(4000r/min)，弃上清液，沉淀为部分纯化的碱性磷酸酶。向此沉淀中加入4.0m1Tris
pH8.8缓冲液，使沉淀溶解，再离心5min(2000r/min)，将上清液倒入试管中，记录体积、弃去沉淀。上清液即为部分纯化的酚液，此为D
液。吸取0．2m1D 液置于编号为D 的试管中，加入0．8m1Tris 缓冲液(pH8.8)，供测酶活性用。
