最新RNAi技术可媲美转基因小鼠模型
基因编辑技术一直都是生命科学的热门研究领域，近来编辑领域出现了可与转基因小鼠技术相媲美的新RNAi干扰技术，该技术由洛克菲勒大学的研究人员研制出，在全基因组水平上首次对小鼠进行RNAi筛查研究，并在数月内发现了导致表皮肿瘤生长的基因，研究成果发表在《自然》期刊上。
RNAi技术筛查致病基因的分子机理是，RNAi通过序列互补作用识别了包含特定序列的基因，进而阻断该基因的表达和翻译，最终发现某些疾病的致病基因。
新RNAi技术短时高通量筛查疾病基因
洛克菲勒大学Elaine Fuchs 教授说：“多年来，由于利用果蝇和线虫能够完成快速的遗传筛查，它们成为了主要的模式生物。而因为在培养皿中易受压力和非生理生长条件的影响，哺乳动物细胞的遗传筛查受到限制。现在我们发明的一项RNAi技术，能够有效地处理活体小鼠胚胎细胞，在体内对小鼠细胞进行全基因筛查，从而避开了哺乳动物在培养皿中的培养难题。”
在全基因组筛查哺乳动物过程中，RNAi是短的小发夹片段，将它们插入到细胞中就能够终止来自特异基因的信息，阻止基因合成蛋白质。一次遗传筛查可能要检测1.5万个基因，采用当前的小鼠基因敲除技术这会是一项大规模、耗时且成本高昂的任务。来自Fuchs哺乳动物细胞生物学和发育实验室的前博士后Slobodan Beronja领导研究人员，构建出了一种特殊的RNAi方法：将所有的小发夹RNA汇集到一起，利用一种病毒将它们注入到妊娠小鼠胚胎中。
Beronja 说，考虑到正常或癌症组织的生长，研究人员在动物体内对每个小发夹RNAs进行了定量，以衡量它们对于生长过程的相对重要影响。这使得研究人员能够用较少的小鼠来筛查更多的基因。该研究小组只用100窝的小鼠筛查了超过1.6万个基因，确定了大约200个对于皮肤恶性生长特别重要的基因。
研究人员发现了几个已知引起肿瘤生长的基因，此外包括Mllt6在内的许多基因都让他们感到惊喜。尽管已有一些研究在白血病中针对Mllt6基因展开调查，以往从未证实它与实体瘤相关联。Beronja 说：“接下来是验证这一包含200多个基因的清单，将范围缩小至真正的药物治疗候选基因。Mllt6是需要进一步进行探讨的一个基因。”
转基因鼠技术是筛查疾病基因的常用方法
转基因鼠技术通过敲入(Knock In)或敲出(Knock Out)方法建立小鼠疾病模型，进而对疾病的发生、发展以及干预措施对疾病影响等方面进行研究。该技术通常涉及到DNA原核注射和ES囊胚注射，这2条技术路线都需要在小鼠早期阶段(受精卵细胞或胚胎干细胞)编辑特定基因并对小鼠模型进行筛选，表现出周期长和疾病基因筛查数量有限的特点。因此转基因鼠技术无法像新RNAi技术一样对成体小鼠进行高通量致病基因筛查，不过它能验证单一基因或少数基因是疾病基因以用于药物治疗靶点。
随着基因编辑技术的发展，科学家几乎可以针对小鼠基因组进行任何DNA编辑动作，因此能确定某一基因在人类健康与疾病上所发挥的作用。迄今，已有一万多个小鼠基因进行疾病研究，而这些基因数目将近哺乳动物基因总数的一半。此外，转基因技术目前已被利用在人类许多疾病的研究上，如心血管疾病、神经退化性疾病、糖尿病以及癌症，而目前受研究人员关注的转基因技术有以下四项：
——ZFN技术制作基因敲除鼠
ZFN 能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。
——TALEN技术制作基因敲除鼠
TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL 的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。
——Gateway 技术制作基因敲除鼠
Gateway 技术是利用噬菌体特异性结合位点可在Clonase 的作用下整合到宿主E.coli 的基因组中的一种新的通用型克隆技术。利用 Gateway 技术构建载体，只需要在目的基因两端加上特异性的15bp 大小的att 结合位点，通过两种Clonase 作用下的BP 和LR 结合反应，即可将目的基因导入载体中，其整合率可达到100%，而且去除了酶切、连接过程，可以避免假阳性的出现，操作十分简便，而近年来将 Gateway 技术运用到基因修饰鼠制作也正被越来越多的科研学者所追捧。
——CRISPR/Cas技术构建因敲除鼠
规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构，其与一系列相关蛋白、前导序列一起，能为原核生物提供对抗噬菌体等外源基因的获得性免疫能力。麻省理工学院怀特海德研究所利用 CRISPR/Cas系统只用三到四周的时间培育出携带5个基因突变的小鼠。
转基因鼠技术发展
80年代后期，由于小鼠ES细胞及同源重组技术的发展而催生的基因打靶技术使得科学家们可以对小鼠的任何基因序列进行随意的修饰，基因打靶技术的发展使生命科学的研究发生了革命性的改变，但用此技术制备基因工程动物模型花费较大，过程较长，而且由于基因的修饰是在ES细胞中进行，目前用基因打靶技术只能用于制备基因改变的小鼠和大鼠动物模型。
近几年，生物学家们发现，两种人工改造过的核酸酶ZFN和TALEN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。ZFN和TALEN技术结合了原核注射的制备周期短和基因打靶技术的定点修饰的特点，而且可以应用到除小鼠和大鼠之外的其他动物。但其脱靶效应(off target)，也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。
今年初以来，一种新的基因组修饰的技术CRISPR/Cas 受到人们的高度重视。 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞(包括iPS)的特定的基因组位点上进行切割，修饰。 Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。 他们将Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变，是目前处于最前沿领域的技术。
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