质谱检测法与蛋白质分析（一）
质谱分析法是蛋白质研究领域和生物大分子研究领域中最重要的分析技术。由于我们对蛋白质鉴定、定量和分析的要求越来越高，希望检测技术的灵敏度也越来越高，同时能够对更为复杂的样品进行分析处理，因此推动了质谱检测技术的发展，出现了一大批新兴的质谱分析方法和仪器。
本文将对近几年质谱技术的发展以及质谱技术在蛋白质领域研究工作中的应用进行一个详细的介绍。
在生命科学研究工作中有一个重要问题，就是发现、鉴定蛋白质并弄清楚它们的一级结构。知道了蛋白质的氨基酸序列信息，我们就可以通过遗传密码将其与编码序列对应起来，从原则上来说，也就将细胞的生理学与遗传学联系起来了。发现、鉴定出了一个蛋白质就好像给我们打开了一扇窗，透过这个窗口，我们就能够对复杂的细胞调控网络有所了解。
在基因组学大步发展之前，我们就已经能够使用化学方法或酶学方法来鉴定蛋白质的一级结构了，不过当时只能对单一的、高度纯化的蛋白质进行分析。我们当时通常采用的方法都是检测紫外线吸光度（ultraviolet absorbance）或荧光光谱分析（fluorescentspectroscopy）的方法。比如用化学逐步降解法，即Edman法来鉴定时是从蛋白质多肽的N端逐步降解至C端，在降解的过程中通过检测紫外线吸光度的办法来辨认每一个被降解下来的氨基酸残基。不过在近20年里，有一种新方法——质谱检测法开始逐步进入到蛋白质鉴定领域。质谱法与化学法结合，为我们提供了更多有用的信息。随着质谱技术的进步，质谱法逐渐成为了蛋白质鉴定方面的首选方法。到了上世纪90年代中期，质谱检测法已经取代了Edman法，成为鉴定蛋白质一级结构的主流方法。
随着人类基因组项目的开展，大家对质谱技术的需求也变得越来越大。人类基因组项目让我们看到，我们可以对复杂的生物系统进行全面的高通量分析。而且人类基因组项目还向我们提供了大量的完整基因编码序列，这对于帮助我们大量、快速鉴定蛋白质序列来说意义重大。于是，继基因组项目之后，又迅速出现了蛋白质组学的概念，即对细胞或组织中的所有蛋白质进行系统研究。在蛋白质组学研究中，质谱技术同样是必不可少的一项重要技术。
不过要对“所有的”蛋白质进行分析实在是一项非常棘手的任务。虽然我们的技术在不断进步，但到目前为止，我们还不可能对任何一个物种的“所有”蛋白质进行分析。该任务最大的难点在于任何一个蛋白质组都非常复杂，而且我们对其复杂程度一无所知。我们所知道的是，任何一个物种蛋白质组组成单位（蛋白质）的数量都要远远超过其基因组中所有基因的数量。这是因为，一个基因可以通过可变剪接的方式、序列多态性方式、翻译后修饰方式以及其它蛋白质处理机制等形成多个蛋白质。而且，这些数量众多的蛋白质各自的浓度差别也非常大，目前没有一款仪器或者方法能够对动态范围如此大的样本群体进行分析。比如我们曾预计血清蛋白质的浓度差别可能超过了10个数量级。虽然分析血清蛋白这个任务也非常困难，但是这还是推动了蛋白质及蛋白质组学分析技术的发展。本文将向您介绍几种质谱检测技术，它们在蛋白质分析领域的应用情况，并对它们在蛋白质组学研究工作中的价值进行讨论。
质谱检测仪以及它们的应用范围
长期以来，质谱技术只能用来分析一些耐热的小化合物，因为我们当时还无法有效地、温和地使样品离子化，也无法有效地在不导致样品断裂的前提下将离子化的样品从固态转变成气态。在上世纪80年代末诞生了两项技术进步，即电喷射离子化技术（electrospray ionization, ESI）和基质辅助激光解析离子化技术（matrix assisted laser desorption/ionization, MALDI）。这两项技术解决了生物大分子的离子化问题，它们的出现，极大地推动了质谱技术的发展，我们终于可以使用质谱技术来分析蛋白质组成问题了。随后又催生出了一大批新型的用于蛋白质和蛋白质组学研究领域的质谱检测仪，比如Q-Q-ToF质谱仪（Hybrid quadrupoletime-of-flight instrument）和ToF-ToF质谱仪（tandem time-of-flightinstrument）等（表1）。质谱仪不仅能够检测蛋白质多肽的分子量和氨基酸序列，还能发现蛋白质的结合位点以及翻译后修饰情况。在检测蛋白质多肽的分子量和氨基酸序列时，使用单级质谱仪（single-stage mass spectrometers）就足够了，而在发现蛋白质的结合位点以及翻译后修饰情况时除了进行单级质谱检测之外，还会选择特殊的离子通过碰撞对其进行裂解分析。在这种串联质谱（tandem mass spectrometry, MS/MS）检测试验中，我们可以通过对蛋白质裂解片段的分析获取详细的蛋白质结构信息。我们下面将要介绍的质谱仪都是在蛋白质研究中最常用到的仪器。这些质谱仪之间在物理原理、性能指标、操作模式以及应用范围方面各有差异。
表1 各种常见质谱仪性能简介；表中√表示具有该功能，（√）表示可选该功能。+、++和+++分别表示可能或适度、好或很好、优秀或非常优秀；Seq表示连续的。
飞行时间质谱仪和hybrid ToF质谱仪
在ToF质谱仪中，我们可以通过某个离子飞越一段长度真空管道的时间推算出它的质荷比（mass-to-charge ratio）。现在，ToF质谱仪的性能已经得到了很大的提升，尤其是在分辨率和准确性方面进步最为明显。现在，分辨力超过12，000已经是质谱仪的常规标准了。如果按照正确的操作规程，也可以达到百万分之一（ppm）级别的准确率。ToF质谱仪是进行ESI质谱和MALDI质谱检测的基础平台。Q-Q-ToF质谱仪在MS模式和MS/MS模式下就具有非常高的分辨率和准确率。在MS模式下，四级杆（quadrupole）起到了引导离子飞行的作用。而在MS/MS模式下，母离子（precursor ions），即在ESI过程中产生的离子被“挑选”出来，进入第一对四级杆，而后在第二对四级杆中借助碰撞诱导解离作用（collision-induced dissociation）被裂解。然后，裂解离子产物经由ToF质谱仪进行分析处理。不论是完全扫描模式（full-scan）还是MS/MS模式，得到的质谱图都具有很高的准确率和分辨率，这也就意味着能获得更多的肽段信息，发现单一同位素信号（mono-isotopic signal）的离子状态和指派（assignment）信息。所有这些信息都给蛋白质鉴定工作带来了极大的便利。有了上述这些信息，再与数据库中的数据进行比对，就能找出检测蛋白质样品的资料。Q-Q-ToF质谱仪在定量分析方面以及蛋白质翻译后修饰情况分析方面的能力也同样出色。
MALDI技术是另一项非常有用的待测蛋白质样品离子化技术，通常都会将MALDI技术与ESI技术相互补充使用。MALDI质谱仪灵敏度非常高，同时，对样品污染（比如，盐离子污染或少量去垢剂污染等）的要求没有ESI质谱仪那么苛刻。最开始，MALDI技术是与ToF质谱仪联合使用用来检测蛋白质分子量的。后来又被应用到Q-Q-ToF质谱仪和ToF-ToF质谱仪上，这样才实现了真正的MS/MS检测。在单电荷（singlycharged）母离子的质谱图和ToF-ToF质谱仪得到的质谱图中都能发现高能量的碰撞裂解片段，这些片段都是蛋白质多肽肽键断裂和侧链断裂形成的，这些信号都很容易被解析。
离子阱质谱仪（Ion trap，IT）
在离子阱质谱仪中，可以捕获离子，因此也可以积累离子。离子阱技术具有无法比拟的高灵敏度和快速数据采集能力。将离子阱技术与数据依赖性采集技术（data-dependent acquisition）结合起来，我们就能进行高通量的质谱检测。不过，离子阱质谱仪的分辨率有限，捕获离子的能力不高，再加上空间电荷效应（space-charging effect）的影响，因此离子阱质谱仪的检测准确度不够高。改进型的线性离子阱质谱仪（linear ion trap analyzers, LIT）具有更高的离子捕获能力，更宽广的动态范围和更高的灵敏度。现在，线性离子阱质谱仪已经取代了传统的四级杆捕获设备。我们通常都会使用线性离子阱质谱仪中的慢速扫描功能来提高分辨率。离子阱质谱仪也都具有多阶段连续MS/MS功能，有了这种功能，我们能够反复分离、裂解某些离子片段，这是发现诸如磷酸化等翻译后修饰情况的好方法。
线性离子阱质谱仪技术已经被运用到三重四级杆质谱仪（triple quadrupole–type instrument）当中，这种新型的质谱仪具有了许多新的功能。Q-Q-LIT质谱仪就是这种三重四级杆质谱仪，它具有母离子扫描功能和中性丢失扫描功能，同时该质谱仪的敏感度也有所提高（图1B、C）。这些新型的质谱仪为我们提供了分析蛋白质翻译后修饰情况的“利器”。此外，Q-Q-LIT质谱仪具有的多重反应监测能力（multiplereaction monitoring, MRM）能够帮助我们发现母离子与某一片段之间的转换情况。将这种MRM技术与高效能循环（high duty cycle）结合起来，就能获得无与伦比的敏感性，并且能够进行定量分析。
Ion source：离子源；MS1：第一个质谱仪；CID：碰撞诱导解离；MS2: 第二个质谱仪；
Product ion scanning：离子产物扫描法；fixed:固定； scanning：扫描；m/z：质荷比；
Precursor ion scanning: 母离子扫描法；time：时间；
Neutral loss scanning: 中性丢失扫描法；Multiple ion monitoring: 多离子监测法；
图1 各种串联质谱检测方法原理示意图。
A：离子产物扫描法（Production scanning）是蛋白质组学研究里最常用的MS/MS质谱检测策略。该方法的目的就是要获得蛋白质片段离子的质谱图，然后据此鉴定出蛋白质的氨基酸序列。在本试验中，第一个质谱仪MS1是用来筛选出某一特定的母离子。随后，被选出的母离子在碰撞池中经由碰撞诱导解离作用（collision-induceddissociation, CID）被进一步裂解成更小的片段，然后这些小片段分子经由第二个质谱仪MS2进行分析、鉴定。对不同的母离子反复进行这种分析最终就可以获得蛋白质的完整氨基酸序列。
B：母离子扫描法。在这里，第二个质谱仪MS2只对一个母离子进入检测。第一个质谱仪MS1对所有母离子进行扫描后挑选出一个母离子进入MS2。通常来说，该方法适用于检测某一样品中包含特殊功能基团的蛋白质亚群，这些基团包括磷酸酯基团或糖基化修饰基团等。
C：性丢失扫描法（Neutralloss scanning）能够以同步的（synchronized）方式同时对两种待测样品进行分析。分子量不同的各种离子可以持续不断地通过MS1和MS2。在碰撞池中，不符合分子量要求的中性片段分子都被筛掉了。因此，该方法适用于分析样品中具有某种特定功能的多肽。该方法最常应用的领域是发现被磷酸化修饰的丝氨酸或苏氨酸位点。
D：离子监测法（Multipleion monitoring, RM）是由一系列的实验组成的。MS1和MS2会分别挑选出一母离子和一特定的能代表该母离子的片段分子。然后，经由一系列的实验转化操作（母离子——小片段分子配对操作），最后收集实验信号（色谱洗脱时间）以供结果分析。MRM方法适合对复杂样品中已知片段特性的特定样品进行分析。
离子回旋加速器与轨道离子阱质谱仪
随着功能强大的带有外部离子源的傅里叶变换-离子回旋加速器（FT-ICR）质谱仪的出现以及商业化，我们在质谱仪的分辨率与准确性方面取得了质的飞跃。有了这种新型的质谱仪，我们现在可以对ppm级乃至亚ppm级的样品进行分析了。该质谱仪的高分辨率特性不仅提高了数据结果的质量，同时也增加了峰容量（peak capacity），因此相比传统的低分辨率质谱仪，FT-ICR质谱仪能够获取更多的信息。配有外部LIT设备的“杂交” FT-ICR质谱仪（hybrid FT-ICR instrument）的发展更是提高了该质谱仪的分析能力，同时也赋予传统的低分辨率MS/MS质谱仪更好的探测母离子的能力。将FT-MS质谱仪与LIT-ICR“杂交”质谱仪结合，就能获得真正意义上的平行全质谱检测仪（parallel full mass spectrum）MS1和串联（而非连续）质谱仪（tandem not sequential mass spectrum）MS2。高质量的MS1检测结果可以用于定量研究。这种策略唯一的缺点就是相对比较低的数据采集速度（平均每个循环只能获得几个数据）和IT设备造成的动态范围较窄。
最近，出现了一种新型的轨道离子阱（orbitrap）质谱仪。这是30年来上市的第一款使用最新物理技术的质谱仪，该质谱仪能分离振荡电场（oscillating electric field）中的离子。在分辨率和准确率方面轨道离子阱质谱仪与FT-ICR质谱仪不相上下，但是它不需要FT-ICR质谱仪使用的昂贵的超导磁铁（superconductingmagnet）。
MS-MS操作模式
串联质谱仪通常使用的都是离子模式来鉴定蛋白质的氨基酸序列（图1A）。目前所有的MS/MS质谱仪都具有该功能。不过表1中列举的其它特殊的质谱仪也具有MS/MS功能。如果要发现蛋白质中的某个功能基团则需要用到母离子扫描功能或者中性丢失扫描功能，而这就必须用到三重四级杆质谱仪，如，Q-Q-Q质谱仪，或四级杆离子阱质谱仪，如，Q-Q-LIT质谱仪。比如复杂混合物里的蛋白质磷酸化位点和糖基化位点就都可以用这种方法（在碰撞池中产生特殊的报告离子，通过它来进行特殊的功能检测）检测出来。在一个典型的质谱检测试验中，首先先用母离子扫描或中性丢失扫描都能发现目标组分，然后再用传统的MS/MS方法鉴定蛋白质的氨基酸序列以及定位修饰位点。
三重四级杆质谱仪在MRM模式下也能以极高的敏感度进行定量分析。已知的或未知的分析物都以极高的敏感度和选择性能被定量检测出来（图1D）。这种高选择性得益于质谱仪能够对代表一个肽段的一对母离子和片段裂解物离子进行实时监测。而且，在MRM模式下进行的两轮选择过程会极大地提高检测的灵敏度，因为，第一轮筛选过后只能剩下很少的离子，这也就将背景噪声减小到了最低水平。碰撞诱导解离片段离子（collision-induced dissociation fragment ions，CID）来源于母离子，这些CID离子能够产生离散信号，而背景化学噪声信号则是随机分布的。最后，由于这种采样时间很长的技术固有的非扫描本质使得它的敏感度非常高，相比离子扫描技术的探测极限（LOD）要高出好几个数量级。
质谱仪的性能
我们已经在表1中对各种质谱仪的性能进行了一个概括。总体来说，质谱仪的性能包括分辨率、敏感度或探测极限和准确性等，这些性能都与质谱仪的类型、采用的离子化方法和扫描能力有关。不过没有哪一个仪器能同时在上述所有方面都全面占优，在选择仪器的时候必须根据实验需要进行相应的取舍。
对实验仪器性能的比较一直以来都是一个存在很多争议的话题。因为性能是服务于需求的，是取决于待测样品和实验步骤的。质谱仪对单独肽段样品进行检测时敏感度总是很低，不过如果生物样品的基质背景（matrix background）很高，那么检测的敏感度就会提高好几个数量级。这种同一款仪器在性能上表现出来的“不稳定性”其实很常见，在仪器处于不同操作条件或状态下时（比如，在最优条件下，常规条件下和大批量处理条件下）它们的性能表现都是不同的。实验目的是：想进行定量分析还是蛋白质鉴定，这也决定了该使用哪种仪器。在蛋白质鉴定试验中，仪器的分辨率（能很好地区分不同组分）和准确性是最主要的，而在定量研究中，敏感度、动态范围和MRM能力才是最主要的。因此，我们应该根据实验目的的需要以及实验设计安排来确定该使用哪种质谱仪。
要想用全扫描模式（full scanmode）获取定量数据的同时再用MS/MS模式获取定性数据是一件非常困难的事情。不过某些“杂交”质谱仪，比如LIT-ICR质谱仪，由于它们能够平行采集数据，因此可以部分解决上面那个问题。精确的定量分析需要源自整个洗脱图（entire elution profile）的高质量的、高信噪比的数据信息。数据质量与数据采集参数高度相关，这些数据采集参数包括扫描时间或者采样时间（对于非扫描质谱仪而言）。因此，我们经常需要在数据质量和样品处理能力（量）之间做出取舍。
最新进展
最近又有几项有关质谱仪的最新进展问世，这些新成果的出现又给我们的生物大分子研究工作补充了“弹药”。在蛋白质测序方面，基于碰撞诱导裂解技术（CID），又新出现了可变裂解技术（Alternate fragmentation technique），该新技术是基于处在碰撞池中的离子具有的电子传递特性开发出来的。目前，电子捕获解离技术（ECD）和电子传递解离技术（ETD）都已经分别被应用到FT-ICR质谱仪和LIT质谱仪上了。运用这两种技术产生的蛋白质裂解产物能与经典的CID方法裂解产物互为补充。不过这两种新方法裂解更均匀，更适合用于发现翻译后修饰情况。ECD技术和ETD技术还都可以用于大型肽段和蛋白质的研究。他们的裂解能力和对完整蛋白的分析能力可以帮助我们直接用质谱仪对完整的蛋白质进行分析，即可以采用所谓的“自上而下（top-down）”的方法进行研究。这样，我们能够获得完整的氨基酸序列信息和翻译后修饰信息，能够对蛋白质进行最准确的鉴定。
-
招标采购
-
精英视角
-
焦点事件
