流式细胞仪在医学研究与检验工作中的应用(2）
22流式细胞仪在肿瘤学中的应用
FCM对DNA、RNA含量及细胞周期的分析具有独到之处。人体正常的体细胞均有较恒定的DNA二倍体含量，细胞癌变过程中伴随细胞DNA含量的改变，DNA非整倍体细胞是恶性肿瘤的特异性标志。根据DNA分布直方图，可对细胞周期的分布状态进行分析，计算出G0/G1比率,S相/(G2+M)比率并了解细胞的增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期比率(S-phase fraction,SPF)作为判断肿瘤增殖状态的指标。此外，DNA指数对肿瘤的早期诊断、鉴别诊断、判断预后及评价疗效有重要意义［4，5］。
221在肿瘤早期诊断中的应用大量工作表明，癌前病变的癌变率与病变的增生程度一致，而增生程度与DNA含量的异常改变又呈平行关系。FCM通过精确定量DNA含量，能对癌前病变的性质和发展趋势作出判断，有助于癌前病变的早期判断。Barrett食管是食管癌的癌前病变之一，Montgomery等用FCM技术对58例Barrett食管进行了分析，发现DNA非整倍体中有77%为高度不典型增生［6］。对于造血系统恶性肿瘤的早期诊断，形态学上一般不具有典型的特征，应用FCM的DNA倍体检测可解决这一问题。Wantzin等曾对7例早期T细胞性淋巴细胞瘤的活体标本进行DNA分析，发现这7例患者的DNA均为非整倍体，而5～12个月后，病理结果才能诊断为淋巴瘤。故认为FCM对淋巴瘤的早期诊断较之形态学方法更为敏感，准确，它可以测得正常细胞与异常细胞间的微小差异，在形态学还不能作出诊断以前，就可以提供确切的疾病信息［6］。
222作为判断良性或恶性间叶组织肿瘤的辅助指标目前，病理学尚不能证实为恶性的交界瘤，经FCM检测出DNA非整倍体细胞时可考虑为恶性肿瘤，而病理学认为两性的肿瘤经流式细胞仪测出非整倍体则提示有恶性转变的可能。
223DNA异倍体与恶性肿瘤预后的关系用FCM分析DNA含量和DNA倍体及S期分析能判断肿瘤患者的预后。通常认为 DNA含量高，非整倍体的肿瘤恶性程度高，预后差，而二倍体或近二倍体肿瘤预后则较好。同时，SPF在估计肿瘤的恶性程度和预后方面也有重要意义。
23流式细胞仪在研究细胞凋亡中的作用
研究细胞凋亡的方法有几种：
①形态学上的电子显微镜检测可区分细胞凋亡和坏死；
②对细胞凋亡的生化特征进行检测，琼脂糖凝胶电泳可见特征性的梯状带；
③FCM检测凋亡细胞是结合了形态学检测、生化改变及DNA含量变化、细胞膜磷脂分布的改变及DNA断裂点标记等几方面。FCM应用于凋亡形态学时，主要是根据细胞凋亡时出现细胞膜皱缩，胞浆浓缩，体积减少；因此检测时前向角散射光(forward scatter, FSC)下降，而侧向角散射光(side scatter, SS)增加，但这种表现只出现于凋亡最早期，所以，形态学检测一般用于凋亡早期。
FCM应用于凋亡较广泛的方法是DNA含量分析。在凋亡过程中，DNA降解，凋亡小体带走部分DNA，造成核内DNA含量下降；在DNA荧光标记时，其染色能力下降，在G1峰前呈现亚二倍体峰，称亚G1期峰。此法的最大优点在于获得凋亡细胞百分数的同时可以与细胞周期中其他时相的细胞进行比较。
检测凋亡较特异的方法可能是对DNA断裂点进行标记后FCM检测。细胞凋亡的最后阶段是形成DNA断片。检测 DNA断片的方法是DNA聚合酶催化的原位缺口转移(in situ nick translation,ISNT)或TdT接到的dUTP原位缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dTUTP nick end labeling TUNEL)技术。ISNT和TUNEL法均可进行间接或直接标记［7］。其优点是：观察细胞数量大，避免由于细胞过少引起的偏差；设立阴性对照，能较客观地检测凋亡细胞群体；可进行凋亡与其他相关因素的联合检测。它较病理学检测，用时短，简便。
在细胞凋亡过程中，半胱氨酰基天冬氨酸蛋白酶家族（caspases）在凋亡早期才能检测到，在凋亡过程中持续升高，凋亡晚期快速下降，通过FCM 对caspases-3的检测，可动态观察凋亡的全过程。此外，可利用细胞凋亡时膜内侧的膜磷脂酚丝胺酸(PS)由膜内侧翻转到膜外的特征进行检测。将荧光标记的亲PS的检测探针 Annexin-V与PI联合标记染色，AV与处于细胞外环境的PS结合。由于早期凋亡细胞膜完整，PI不能通过完整的细胞膜，因此可定量检测早期凋亡细胞（V-FITC+/PI-群）及坏死细胞(V-FITC-/PI-群)［8］。
