血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析

前言

血小板活化试验，对于血小板功能、心血管疾病的研究，有重要意义。使用流式细胞仪进行多参数分析，可以特异、灵敏地检测血小板表面标记，了解血小板的活化状态和反应性，并同时获得更多关于血小板的信息。在疾病监测、血小板疾病患者的筛选、预测并发症等方面有良好的应用前景。

使用推荐的三色流式分析方法检测血小板活化的优点是：

检测血小板的反应性；了解血小板活化进程；血小板先发生膜糖蛋白变化，然后是胞浆内颗粒释放到血小板外。同时检测多种血小板表面标志；高度灵敏；直接检测血小板的多种标志；使用全血，标本量少；操作简便快捷，将血小板人工激活减至最低。

BDIS血小板活化试剂组成为：

PAC-1 FITC：血小板活化早期的标志物，即活化的 gpⅡb/Ⅲa复合物，抗体与活化后血小板膜表面的gpⅡb/Ⅲa复合物纤维蛋白原结合位点相结合。BDIS抗体为IgM型，建议使用PAC-1结合阻断剂RGDS做阴性对照。

CD62P PE：血小板活化后期的标志物，特异地与活化血小板结合。静止血小板胞浆内a颗粒含有CD62P，血小板活化时，颗粒内糖蛋白向膜外释放，血小板表面表达CD62P。

CD61 PerCP：特异的泛血小板表面标记，既与活化血小板结合，也与静止的血小板结合。CD61与CD41联合，即为血小板表面gpⅡb/Ⅲa复合物。在本试验中，用FL3设阈值。

试验用品

采血管：枸橼酸钠抗凝的真空采血管；一次性12×75 mm Falcon试管；微量加样器和加样头；BD抗体：2-8℃保存。

RGDS (PAC-1阻断剂)：用PBS配制，10mg/ml。

血小板激活剂：ADP，浓度2×10－4M，2-8℃保存。也可选用其他激活剂，如PMA、纤维蛋白、TRAP。

PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8℃保存。

固定液：含1%多聚甲醛的PBS缓冲液，2-8℃可保存一周。

振荡混匀器。

FACS流式细胞仪：进行数据获取。

CaliBRITE Beads/FACSComp软件：FACS仪器校正，预设获取条件。

CellQuest软件：试验数据获取和分析软件。