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抗体的概念、动物产生抗体的机理及单克隆抗体...(三)

2020.5.19

单克隆抗体杂交瘤技术基本流程

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单克隆抗体的制备步骤

1、免疫原的制备;

2、免疫动物 ;选择体重18-20g BALB/C 雌性小鼠用于免疫。50-100ug抗原/只与等体积福氏完全佐剂混合,充分乳化后,经背腹部皮下多点注射及腹腔注射相结合的方式免疫,总的免疫体积0.2-0.3ml每只;间隔3周,取与一免减半量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后,第二次腹腔注射0.2-0.3ml每只;过2-3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射,3天后取脾细胞进行融合;

3、细胞融合 ;取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5-10:1的比例,在无血清的RPMI-1640培养基中混匀,1500rpm离心5min,去除培养基;用50% PEG(Sigma,分子量1500-4000)作为融合剂,在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml,使其融合2min;用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min,沉淀用HAT培养基悬浮,分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中,37℃,5% CO2的细胞培养箱中培养。杂交瘤细胞的制备过程

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4、杂交瘤细胞及阳性孔的筛选;细胞培养器皿中培养5天后,用HAT培养基换液一次,第10天用HT培养基换液,等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时,用常规间接ELISA方法筛选阳性孔,获得对上述抗原有反应的阳性孔; 

5、阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆;阳性孔的特异性鉴定采用间接ELISA方法:用包被液稀释成1-10ug/mL的抗原100ul/孔包被ELISA板,4℃过夜,使其吸附于聚苯乙烯板孔;PBST洗涤三次后用1-10%的脱脂奶粉封闭30-60min;加入阳性孔培养上清100ul/孔,37℃ 1-2 小时;PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100ul/孔,37℃ 1-2小时,PBST洗涤四次后,用OPD-H2O2底物显色,2mol/L H2SO4终止反应后,用酶标仪读取OD492的值,以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。获对抗原有特异性反应的阳性孔。筛选出的特异性阳性孔用常规的有限稀释法克隆,获能分泌抗原特异性抗体的杂交瘤细胞株。细胞株进一步扩大培养,用于制备单抗腹水和液氮冻存;

6、杂交瘤细胞和一般细胞的冻存及复苏方法;杂交瘤细胞通常用含有8%-10%的二甲亚砜和30%小牛血清的培养基冻存于液氮中,在液氮中细胞可以保存多年,在-80℃中可以作3-6个月短期保存。冻存细胞需要缓慢降温(4℃冰箱放置15-30分钟,-20℃冰箱放置30-60分钟,-80℃超低温冰箱中放置24小时),然后放置液氮中长期保存;也可用细胞程序冻存盒直接放置-80℃超低温冰箱。复苏细胞时需快速升温,这样可以确保细胞有较高的存活率。冻存细胞管直接放入37℃水中快速升温复苏,离心后去冻存液,沉淀的细胞用培养基悬浮后细胞培养箱培养;

7、单克隆抗体腹水制备及纯化;取8周龄左右BALB/C小鼠,腹腔注射0.3-0.5ml降植烷,7-10天后腹腔注入5-10×105个杂交瘤细胞,7-10天后可见小鼠腹部明显膨大,取腹水,3000rpm离心3min,收集上清液,即为单克隆抗体腹水。纯化:取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释,加辛酸(30ul/ml腹水),室温下边加边搅拌,4℃澄清1小时,12000rpm离心30min,收集上清,再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白,4℃放置2小时,5000rpm离心5min,沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解,在4℃PBS流动透析24小时后即获纯化的抗体,-70℃保存;

8、单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定;将单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C 小鼠IgA、IgG1、IgG2a、 IgG2b、IgG3、IgM抗体,作双向琼脂扩散试验或双抗夹心ELISA方法鉴定。用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价,腹水效价在10-5-10-7之间的可用于实际应用;aHR0cHM6Ly9tbWJpei5xbG9nby5jbi9tbWJpei95cVZBcW9adkRpYkdZM0Zzd0pwaWJaNVc1Z1A4T2dVbWhiaDVRa2dtVTR0NnZBc2czV0NyNWljNTJQWWtxMXc2R29pY0JpYnI3dmd0VTZ5aWNod2M1bjdMZXlnZy8wP3d4X2ZtdD1wbmc=

酶联免疫吸附试验技术(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)(定量、定性实验)

ELISA是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种免疫测定技术,既可以定性也可以定量。主要过程包括将已知抗原(抗体)吸附在固相载体即聚苯乙烯微量滴定板上称为包被,然后用封闭液(5% BSA/PBS 溶液)将空余的位点占据,以避免后续抗体非特异性吸附。洗涤后加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体,形成已知抗原--待测抗体--酶标二抗的复合物,再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算待测抗体(抗原)的量。

ELISA原理

(1) 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性;

(2) 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性;

(3) 酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果;

常用ELISA方法

1、直接法:检测抗原

A:将待检测抗原吸附在固相载体表面;

B:加酶标抗体,形成抗原-抗体-酶复合物;

C:加底物。底物的降解量=抗原量。 

2、间接法 :检测抗体(本次ELISA方法)

A: 将已知抗原吸附于固相载体表面;

B: 加待检测抗体,形成抗原抗体复合物;

C: 加酶标二抗;

D: 加底物。测定底物降解量=抗体量

3、双抗体夹心法:检测抗原

A:将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面; 

B:加待检抗原,形成抗原-抗体复合物;

C:加抗原免疫第二种动物获得的抗体,形成抗体抗原抗体复合物; 

D:加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体);  

E:加底物。底物的降解量=抗原量。

4 竞争法:测定抗原

A:将抗体吸附在固相载体表面;  

B:对照孔只加入酶标抗原;

C:样品孔加入酶标抗原和待测抗原,竞争结合抗体; 

D:加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差=未知抗原量。

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