实验材料 牛小肠碱性磷酸酶虾碱性磷酸酶蛋白酶 K限制性内切核酸酶DNA 样品

试剂、试剂盒 氯仿EDTA乙醇酚氯仿SDS醋酸钠TETris-ClCIP 去磷酸化缓冲液SAP 去磷酸化缓冲液

仪器、耗材 水浴或加热板

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

氯仿

EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0) 或 EGTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0) (如使用 CIP)

乙醇

酚：氯仿（1:1，V/V)

SDS (10% m/V）( 如使用 CIP)

醋酸钠（3 mol/L，pH 7.0 [ 如使用 CIP] 和 pH 5.2)

TE ( pH 7.6)

Tris-Cl（1 mol/L，pH 8.5)

2. 酶和缓冲液

牛小肠碱性磷酸酶（CIP) 或虾碱性磷酸酶（SAP) (US Biochemical 公司， Boehringer Mannheim 公司或 Worthington Biochemicals 公司）

10X CIP 去磷酸化缓冲液或 10X SAP 去磷酸化缓冲液

蛋白酶 K

限制性内切核酸酶

3. 核酸和寡核苷酸

DNA 样品（0.1~10 μg [ 1-100 pmol]）

4. 专用设备

预先设定至 56℃、65℃ 或 75℃ (CIP) 或 70℃ (SAP) 水浴或加热板

二、方法

1. 用所选择的限制性内切核酸酶完全消化 1~10 μg (10~100 pmol) DNA 使去磷酸化。

2. 用 CIP 或 SAP 使已经限制酶切的 DNA 5' 端去磷酸化。

(1) 用 CIP 进行 DNA 的去磷酸化

① 向 DNA 中加入：

10X CIP 去磷酸化缓冲液  5 μl

水                                 加至 48 μl

② 加入适量的 CIP。

③ 37℃ 温育反应 30 min 后，加入第二等份 CIP，继续温育 30 min。

④ 在温育反应结束后，加入 SDS 和 EDTA（pH 8.0) 至终浓度分别为 0.5% 和 5 mmoI/L 以灭活 CIP，充分混匀备试剂，再加入蛋白酶 K 至终浓度为 100 μg/ml，56℃ 下温育 30 min。

⑤ 将反应冷却至室温，先用酚: 氯仿抽提 2 次，再以氯仿单独抽提 1 次以纯化 DNA。

(2) 用 SAP 进行 DNA 去磷酸化

① 向 DNA 中加入：

10X SAP 去磷酸化缓冲液     5 μl

水                                      加至 48 μl

② 加入适量的 SAP。

③ 37℃ 温育反应 1 h。

④ 为灭活 SAP，将反应转移至 70℃ 加热 20 分钟，然后冷却至室温。

3. 将水相转移至一个清洁的微量离心管中，如用 SAP，则在 0.1 体积的 3 mol/L 醋酸钠（pH 5.2) 的存在下用标准乙醇沉淀回收 DNA；如使用 CIP，则用 0.1 体积的 3 mol/L 醋酸钠（pH 为 7.0）。

4. 室温下干燥沉淀物，然后溶于 TE (pH 7.6)，使 DNA 的浓度 > 2 nmol/ml。