3.1.4 双链 DNA 合成

( 1 ) 混合大约 1 μg 尿嘧啶单链 DNA、2 μl 磷酸化的寡核苷酸（见 3.1.3)，1 μl 10 X 退火缓冲液（Bio-Rad  Metagene  kit ) ，加水使体积达 10 μl  ( 见注4)。制备一无寡核苷酸的对照反应。

( 2 ) 使用聚合酶链反应（PCR) 仪，在 70°C 保温 5 min，然后以每分钟降 1°C 的速度，降温至 30°C。将试管置于冰上。

( 3 ) 在退火混合物中，加入 1 μl 10 X 合成缓冲液（ Bio-Rad  Metagene  kit ) 、1 μl T4 DNA 连接酶和 1 μl T4 DNA 聚合酶（New  England  Biolabs)。在冰上和室温相继保温各 5 min，37°C 保温 30 min，75°C 保温 15 min，然后冷却至室温。将 1 μl 样品通过琼脂糖胶 ( 电泳）。含有寡核苷酸的样品会得到比无核苷酸的对照样品所得分子质量高的产物。

( 4 ) 把一滴混合物放在飘在水上的 0.025 μm 透析膜碟上，透析合成混合物 1 h，然后在新的微离心管中复原透析过的混合物。使用前保存在冰上。

3.1.5 电穿孔胜任细胞的制备

( 1 ) 在 350 ml 含 Tc 的超级肉汤中培养大肠杆菌 SS-320 直至 OD600 达到 0.8。

( 2 ) 在冰浴中快速冷却三角瓶中的培养液，然后放置在冰上 15 min。将培养液移至离心瓶，在 0~2°C 以 3900  g [ 4700 r/min，用 JA -10 (Beckman) 或等效转子 ] 离心 5 min  ( 见注 5)。

( 3 ) 撇去上清液，通过在冰上敲击离心管，将细胞悬浮于 10 ml HEPES 缓冲液中。 加入 390 ml HEPES 缓冲液，并搅动使细胞悬浮。在 0~2°C 以 3900 g 离心 5 min。

( 4 ) 撇去上清液。将细胞悬浮于 10 ml HEPES 缓冲液中并将悬浮物移至 50 ml 离心管。用缓冲液漂洗第一个瓶子并在 50 ml 离心管中恢复细胞悬浮。

( 5 ) 在 0~2°C 以 4300 g ( 6000 r/min，用 SS-34 转子）离心 10 min。去上清液。在冰上敲击离心管使细胞悬浮于 10 ml 10% 甘油中，然后加入 20 ml 10% 甘油，并将离心管颠倒数次以使悬浮物混合。

( 6 ) 在 0~2°C 以 4300 g 离心 10 min。去上清液。加 300 μl 10% 甘油，并在冰上敲击离心管使细胞悬浮。检查体积，加 10% 甘油使终体积达 700 μl。将悬浮物等分至两个离心管中（各 350 μl)。

3.1.6 噬粒 DNA 电穿孔转染

( 1 ) 将冷却的 DNA [ 见 3.1.4，第（ 4 ) 步 ] 加入放在微离心管中的 350 μl 电转化感受态细胞中，并在冰上保温 5 min。将混合物移至预冷的电穿孔试管中（2 mm 间隙)。

( 2 ) 电穿孔细胞，如在 2.5 kV 高压模式下使用 BTX  ECM395 电穿孔器。

( 3 ) 立即在试管中加入 1 ml SOC，并使细胞悬浮。转移细胞至 250 ml 三角瓶。加 1 ml SOC 到试管中，清洗残留细胞并移入三角瓶中。再重复此操作 3 次。

( 4 ) 三角瓶中加入 20 ml SOC。在 37°C 以 180 r/min 摇动三角瓶 30 min。并通过放置部分稀释的悬浮物至 LB- Ap 平板检查浓度。

( 5 ) 将全部悬浮物加至 500 ml 预热的 2 X YT-Ap 中。为酵母双杂交的质粒制备，在 37°C 摇动过夜并制备质粒。为噬粒制备，加入 1010 pfu/ml 辅助噬菌体 KO7，在 37°C 摇动过夜，并如 3.1.1 节所述制备噬粒。

为噬菌体 DNA 的转化，在第 （3 ) 步之后，加入 1.5 ml 中对数期 SS -320 细胞，然后将悬浮物移至预热的 120 ml 2 X  YT-Tc。按照 3.1.2 节所述测定噬菌体浓度。37°C 保育 4 h。按照 3.1.1 节所述制备噬菌体。

3.1.7 酵母实物库构建

为酵母双杂交筛选，在大肠杆菌中，我们按照 3.1 节的描述构建了载体库，然后将这个库引入酵母中。酵母转化系基于 Gietz 的方法 [18] 。用这个方法，我们在典型情况下得到约 106 个独立克隆。

( 1 ) 在 30°C，20 ml YPD 中摇动过夜生长酵母 EGY48。将培养液加入预热的 300 ml YPD 使 OD600 值为 0.25。让细胞生长直至 OD600 值接近 1。

( 2 ) 在室温下以 3600 g ( 4500 r/min，JA-10 转子）离心 5 min 。撇去上清液，并悬浮细胞于 300 ml 灭菌水中。重复离心和悬浮。再离心，悬浮细胞于 25 ml 灭菌水，并移至 50 ml 离心管中。室温以 3000 g  ( 5000 r/min，SS34 转子）5 min。撇去上清液，并悬浮细胞于 1.2 ml 灭菌水。

( 3 ) 将 35 μl 细胞悬浮物放在一边用作负对照。在余下的细胞悬浮物中加入 7.2 ml 50% PEG3350、1.08 ml 1 mol 乙酸锂、500 μl 携带子单链 DNA ( Origene) 、45 μg DNA 和 900 μl 水。彻底混匀，并每份 360 μl 分装入 30 个微离心管中。在负对照管中加入 1/30 除 DNA 外的上述材料（即 PEG、乙酸锂和携带子 DNA ) ，彻底混匀。

( 4 ) 在 42°C 保育 40 min。在微离心机上以 10000 r/min 转速室温离心 10s，撇去上清液。悬浮每管中的细胞于150 μl 水中。将细胞铺在直径为 15 cm 的筛选平板上（YC Glc trp - ) 上 。30℃ 保育 3 d。

( 5 ) 每皿加入 15 ml 水，用灭菌的盖玻片刮散所有菌斑。把所有细胞悬浮在 500 ml 离心管中，并以 3900 g  ( 4700 r/min，JA-10 转子）离心 5 min。撇除上清液，悬浮细胞于 500 ml 水中。再次离心并撇除上清液。悬浮细胞于 50 ml 水中，并测量 OD600 以确定细胞密度（ 1 OD600 对应于约 2X107 个/ml ) 。加入甘油至终浓度 15%  ( V/V ) 。分装并保 存细胞悬浮物于 -80°C。

3.2 噬菌体展示库分类

3.2.1 扫视（panning)

( 1 ) 加入 50 μl 涂渍溶液到酶联免疫吸附试验酶标板（Nunc Maxisorp，可分小孔，C-bottom ) 的小孔中（每孔1 μg 的配体）。把酶标板放入一铺有湿纸巾的密封盒子中。保持盒子在 4°C 过夜，或 37°C 1 h。

( 2 ) 用移液器除去液体，并用水清洗小孔两次。加入 360 μl 含 3% BSA 的 TBS 于小孔中。37°C 保育 1 h。为了下一轮实验，制备一对照小孔；加入无配体的缓冲液，并用 BSA 封闭小孔。

( 3 ) 从小孔移除封闭液，用水清洗两次。加入 12 μl 5% BSA 溶液和 50 μl 噬菌体悬浮物（1011 个/孔）。室温保育 2 h。

( 4 ) 移除噬菌体溶液，然后加入 360 μl TBST。用吸管上下有力地吸动。等待 5 min 然后移除溶液（ 第一轮一次，以后每轮 5 次)。

( 5 ) 在小孔中加入 50 μl 含有 10 μmol/L 配体的 TBST 溶液。37°C 保育 1 h，用吸管上下有力地搅动，回收洗脱物。也可以加 50 μl 酸性洗脱缓冲液到小孔中，室温等待 10 min。用吸管上下有力地搅动。回收第二次洗脱物到装有 3 μl 2 mol/L Tris-碱的微离心管中，准备中和。

( 6 ) 混合 5 ml 新鲜的 XL- 1 Blue  ( OD600 值为 0.5~1；在 LB-Tc 中生长的）和洗脱的噬菌体。对噬菌体，加入 100 ml 2 X YT  [ 和异丙基巯基半乳糖苷（ IPTG ) 直至 1 mmol/L 以得到独体的高产出 ]，并在剧烈摇动的同时，于 37°C 保育 6 h ( 更长的保育时间可能导致独体基因删除）。加入 2 X YT 后立即按 3.1.2 节所描述的测定浓度。对噬粒，混合 5 ml 新鲜的 XL-1 Blue 和洗脱的噬粒，37°C 保育 20 min、加入 100 ml 2 X YT ( 以及 IPTG，如果需要）、100 μg/ml AP 以及 1010 个/ml 的辅助噬菌体 KO7；在 37°C 保育 2 h 并保持有力地摇动。Km 至终浓度 70 μg/ml 并保育过夜。保育 20 min 后立即按 3.1.1 节描述测定浓度。按 3.1.1 和 3.1.2 节所述，分 离噬菌体（或噬粒)。重复整个步骤，直至洗脱的噬菌体（或噬粒）数增加。