RFLP技术和RAPD技术-2

第三节 RAPD技术

一、 材料

不同来源的DNA(50ng/ul)。

二、设备

PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，电泳装置。

三、试剂

1、随机引物(10mer) (5umol/L)：购买成品。

2、Taq酶：购买成品。

3、10xPCR 缓冲液：配方见第八章。

4、MgCl2 ：25mmol/L。

5、dNTP：每种2.5mmol/L。

四、操作步骤：

1. 在25ul反应体系中，加入

模板DNA 1ul (50ng)

随机引物 1ul (约5pmol)

10xPCR Buffer 2.5ul

MgCl2 2ul

dNTP 2ul

Taq酶 1单位（U）

加ddH2O 至 25ul

混匀稍离心， 加一滴矿物油。

2. 在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃ 2分钟， 然后循环: 94℃ 1分钟， 36℃ 1分钟， 72℃ 1分钟，共40轮循环。

3. 循环结束后， 72℃ 10分钟，4℃保存。

4. 取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于2% 琼脂糖胶上电泳， 稳压50-100Ｖ（电压低带型整齐， 分辨率高）。

5. 电泳结束，观察、拍照。

[注意] 1、电泳时一般RAPD带有5-15条， 大小0.1-2.0kb。

2、 特异性的DNA带可以克隆作为一个新的分子标记应用。
思考题

1. DNA酶切反应不彻底会有何结果? DNA发生降解有何影响？

2. Southern转移中脱嘌呤时间为何不能太长？

3. 随机引物扩增，为什么会产生DNA双链产物?

RAPD技术，即随机扩增多态DNA(Random Amplified Polymorphic DNA)技术，是由美国科学家J.Williams和J.Welsh两个研究小组在聚合酶链式反应(Polyinerase Chain Reaction，PCR)技术的基础上发展起来的，它是一种用于检测基因组DNA多态性和基因组遗传标记的方法。目前已被广泛应用于系统发育研究、动植物种类鉴定、基因图谱构建、种群的遗传分析、人类基因组研究等领域。

1　RAPD技术的原理

RAPD技术是建立在PCR技术的基础上，它用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基序列的寡核苷酸单链(一般为10个bp)作为引物，对所研究的基因组DNA进行单引物扩增。模板DNA经90—94变性解链后在较低温度(36～37℃)下退火，这时形成的单链模板会有许多位点与引物互补配对，在 72℃下，通过链延伸，形成双链结构，完成DNA合成。重复上述过程，即可产生片段大小不等的扩增产物，通过电泳分离和显色便可得到许多不同的条带，从中筛选出特征性条带。扩增产物片段的多态性反映了基因组DNA的多态性。如果基因组在这些区域内发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点的分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。因此，通过对PCR产物的检测即可测出基因组DNA在这些区域的多态性。进行 RAPD分析时，可用引物的数量很大，虽然对每个引物而言，其检测基因组DNA多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此，RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。

RAPD技术的优点：①不使用同位素，减少了对工作人员健康的危害；②可以在物种没有任何分子生物学研究的情况下分析其DNA多态性；③对模板 DNA的纯度要求不高；④技术简单，无需克隆DNA探针，无需进行分子杂交；⑤灵敏度高，可提供丰富的多态性；⑥RAPD引物没有严格的种属界限，同一套引物可以应用于任何一种生物的研究，因而具有广泛性、通用性。

但是，RAPD技术较易受到各种因素的影响。无论是模板的质量和浓度，短的引物序列，PCR的循环次数，基因组DNA的复杂性，技术设备等，都有可能是RAPD技术重复性差的直接原因。目前，多从以下几个方面来提高反应的稳定性：①操作规范，反应体系的组成要力求一致，尽可能地使RAPD反应标准化；②提高扩增片段的分辨率；③将RAPD标记转化为SCAR标记后再进行常规的PCR分析，可以提高反应的稳定性及可靠性。

2　RAPD技术在鱼类、虾蟹类研究中的应用

2.1在遗传资源研究中的应用

目前，海产虾、蟹类遗传变异的检测大多通过检测同工酶的变异来进行，所揭示的同工酶的多态性相对较低。RAPD分析中所需的样品量极少，其操作程序简单易行，实验周期短，因而可以对数量较多的样品进行分析。利用一套引物可得到不同种属、品系、群体甚至是个体的大量的RAPD分子标记，并可借助于计算机进行系统分析，RAPD技术的这些特点使得它可以在虾、蟹类群体遗传学、遗传多样性分析中发挥重要作用。

RAPD标记可以用来进行虾、蟹类群体遗传学研究，检测种群内、种群间的遗传多样性水平，并为种群识别提供可靠的遗传标记。Garcia等尝试在斑节对虾中利用RAPD分析不同地理群体间的遗传多样性，并就其在虾类选育中的应用作了初步探讨。Garcia以及A1civar—Warren等在高健康 (High Health Shrimp)和无特异病原(Specific—Pathogen—Free，SPF)的南美白对虾培育中，用RAPD技术对野生种群以及不同的家系进行监测和分析，发现其多态位点的比例为50%左右，其中一个家系的多态位点比例高达77%。刘萍等用RAPD技术对中国对虾黄渤海沿岸种群亲本及子一代的基因组DNA多态性进行了研究，结果证实子代之间的遗传距离比其父母与子代之间更小，遗传变异程度更低。邱高峰等用RAPD技术分析了我国近海烟台、长岛等 4个地方的20只中国对虾的种群内和种群间遗传差异，结果表明不同地理种群之间存在一定程度的遗传差异。石拓等，刘萍等、刘振辉等对中国对虾不同地理种群的遗传多样性进行了RAPD分析，结果表明，中国对虾的遗传多样性水平较低。高志干等对中华绒螯蟹的辽河和长江种群进行RAPD分析，结果显示，其种内遗传变异较低，3个种群中，辽河种群和颐江种群遗传变异较高，而长江种群遗传变异较低；辽河种群间遗传距离小于它们与种群间的遗传距离。甘西等利用RAPD 技术对罗氏沼虾的NY群体和NX群体的遗传多样性进行了研究，NY群体的变异明显小于NX群体。宋林生等及庄志猛等用RAPD技术研究了日本对虾野生种群和养殖种群的遗传结构，结果表明，野生种群多态性位点的比例和杂合度明显高于养殖群体，说明中国沿海的日本对虾野生种群的种质资源状况较好，应加以保护。