摘要：目的 研究中药药对虎杖-桂枝对急性痛风性关节炎的影响。方法 取雄性 SD 大鼠 48 只，随机分为 6组（每组 8 只），即正常对照组，模型组，秋水仙碱组（0.1 g·kg-）1，虎杖-桂枝低、中、高剂量组（3.5，7，14 g·kg-）1。正常对照组和模型组给予等量生理盐水，其他各组给予相应药物灌胃，每天 1 次，连续 7 d。于灌胃的第 4 天.模型组与各给药组大鼠右后踝关节注射 25 mg·mL-1 尿酸钠（MSU）0.2 mL 1 次，正常对照组给予同量的生理盐 水，观察各组大鼠不同时间点足趾容积的变化；第 7 天灌胃 1 h 后取血，ELISA 法测定血清白细胞介素 1β（IL-1β）、转化生长因子-β（TGF-β）含量，荧光定量 PCR 检测外周血单核细胞 Toll 受体 2（TLR2）、Toll 受体 4（TLR4）及髓样分化因子 88（MyD88）的表达。取血后处死动物，取右后踝关节进行病理学观察。结果 与模型 组比较，在造模后 2 h 和 6 h 虎杖-桂枝药低、中剂量组可显著减小大鼠足趾容积率，48 h 和 72 h 虎杖-桂枝 药对低、中、高剂量组大鼠足趾容积均显著减小，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。虎杖-桂枝药对各剂量组可不 同程度的减少关节滑膜炎症细胞浸润反应和血管充血程度。与模型组比较，虎杖-桂枝药对各剂量组可显著减 少 IL-1β 的含量，抑制 TLR2、TLR4 及 MyD88 基因的表达（P ＜ 0.01）。结论 虎杖-桂枝药对低、中、高剂量 组对急性痛风性关节炎大鼠具有显著的改善作用，其机制可能是通过影响血中 IL-1β 的水平，下调 TLR2、 TLR4、MyD88 基因的表达来发挥作用。

　　关键词：虎杖-桂枝药对；痛风性关节炎；TLRs/MyD88 通路；大鼠急性痛风性关节炎是由血液尿酸增高，尿酸钠（MSU）结晶沉积于关节滑膜及周围组织而引起的急性炎症反应 [1]。临床治疗痛风的药物主要为化学药，长期使用具有较大的副作用，中药长期使用毒副作用小，具有显著优势。既往研]表明，含有虎杖的复方对痛风具有明显疗效；桂枝及其提取物能拮抗多种急、慢性炎症反应，具有显著的抗炎作用。

　　本课题组 前期研究[3]发现，药对虎杖 -桂枝对急性痛风性关节 炎具有显著的改善作用，但其作用机制仍未阐明。 MSU 晶体作为一种危险信号被细胞表面和胞质的模 式识别受体，如 Toll 受体 2 （TLR2）、Toll 受体 4 （TLR4）、CD14 等分子所识别，TLR2/TLR4 与病原 相关分子模型（PAMPs）结合后，其本身结构发生二 聚化，活化髓样分化因子 88 （MyD88）， 活化后的 MyD88 经过一系列的作用最终激活核转录因子 kappa B（NF-κB）以及后续白细胞介素 1β（IL-1β）的释放。 国内外研究[表明， 痛风出现的炎症发病机制与 TLRS/MyD88 信号转导通路密切相关。本研究通过建 立急性痛风性关节炎大鼠模型，探讨药对虎杖 -桂 枝对急性性痛风性关节炎及 TLRS/MyD88 信号的影 响。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 SD 大鼠，雄性，SPF 级，体质量（200±20）g，广东省动物中心提供，动物许可证号：SCXK （粤）2008-0002。

　　1.2 药品及试剂 秋水仙碱，西双版纳药业有限责任 公司，批号：130313；尿酸钠，Sigma 公司，批号： BCBH7155V；虎杖、桂枝均购自康美药业，经本院 中药鉴定教研室李忠教授鉴定为真品。取虎杖、桂枝， 分别加 10 倍水， 浸泡 30 min， 虎杖煎煮 25 min，桂枝后下煎煮 20 min，过滤；药渣加 5 倍水， 煎煮 40 min，合并滤液，离心，上清液浓缩，定容， 灭菌，冷藏备用。MSU 溶液参考文献[2]方法制备。大鼠外周血淋巴细胞分离液，天津市灏洋生物制品科技 有限责任公司， 批号： LTS1083； Trizolf， 美国 intrivogen 公司，批号：15596-026。RNA 逆转录试剂 盒，Premix TapTM，SYBR Premix Ex TapTM Ⅱ ， 均为 宝生物工程（大连）有限（Takara）公司产品，批号分 别为：RR047A、RR901A、RR820A；白细胞介素 1β （IL-1β）和肿瘤坏死因子-β （TGF-β） Elisa 试剂盒， 均为美国昂飞公司（eBioscience）产品， 批号分别为 BMS630 和BMS623。

　　1.3 仪器 YLS-7C 足趾容积测量仪，北京众实迪创 科技发展有限责任公司；NanoDrop 2000c 型紫外分光 光度计、MuLTiskan Go 型酶标仪， 美国赛默飞 （Thermo）公司；Mastercycler 型 PCR 扩增仪，德国艾 本德（eppendorf）公司；DOLPHIN-1D 型凝胶成像分析 仪，美国威泰克（Wealtec）公司；VIIA7 型荧光定量 PCR 仪，美国应用生物系统（ABI）公司。

　　1.分组、模型复制及给药 取 SD 大鼠 48 只，随机 分为 6 组（每组 8 只），即正常对照组，模型组，阳性药秋水仙碱组（0.1 g·kg-1），虎杖 -桂枝低、中、高 剂量组（3.5，7，14 g·kg-1，分别相当于成人临床剂量

　　1.1，2，4 倍）。正常对照组和模型组给予等量的生 理盐水，其他各组给予相应药物灌胃，每天 1 次，连 续 7 d。于灌胃的第 4 天给药之前先测量大鼠右后足 趾容积，灌胃 1 h 后除正常对照组外，其余各组大鼠 乙醚麻醉，6 号针头针口斜面朝前上方与胫骨呈 45°夹角刺入右踝关节腔， 一次性注入 25 mg·mL-1 的 MSU 溶液 0.2 mL， 复制大鼠急性痛风性关节炎模型，并于造模后 2，6，24，48，72 h 分别在受试大 鼠踝关节相同部位，用足趾容积测量仪测量其容积。

　　1.样本采集及指标的检测 第 7 天给药后 1 h，眼 眶取血置于 EP 管和 EDTA-2K 抗凝管中，Elisa 试剂 盒检测 IL-1β 和 TGF-β 含量；Ficoll 法分离外周血单核细胞[8]，采用 Trizol 法提取单核细胞的总 RNA，测 定 OD260 nm/OD280 nm 为 1.8~2.0 者采用，进行逆转录操作，严格按照试剂盒说明书进行，荧光定量 PCR 检 测 TLR2、TLR4、MyD88 表达水平。引物由宝生物 工程（大连）有限公司设计及合成， 以 β-actin 基因 序列为内参照物，引物序列见表 1。反应采用 20 μL 反应体系，严格按照 SYBR Premix Ex TapTM Ⅱ试剂 盒说明书进行。设置空白对照组的基因表达水平为1。公式 2 -Ct=2-{ [Ct（ 给药组） -Ct（ 对照组）]} 目的基因 -{[Ct（ 给药组） -Ct（ 对照组）]}β-actin。处死大鼠，取右后踝关节，多聚甲醛溶液固定 24 h，置于 150 g·L-1 乙二胺四乙 酸（EDTA）中脱钙 1 周，常规脱水，石蜡包埋，经髁 突矢状面低温连续切片，厚度为 5 μm，HE 染色， 于光镜下观察病理组织形态学变化。

　　1.6 统计学处理方法 数据采用 SPSS19.0 统计软件 进行分析，结果以“x ± s”表示，方差齐性使用 LSD法进行比较，分级组间多重比较采用非参数秩和检验。

　　2 结果

　　2.1 药对虎杖-桂枝对急性痛风性关节炎大鼠足趾容

　　表 1 引物序列

　　Table 1 Primer sequences for PCR

　　基因 引物序列

　　β-actin F：5’-TgAgACCTTCAACACCCC-3’

　　R：5’-gCCATCTCTTgCTCgAAgTC-3’

　　 TLR2 F：5’-ggCCACAggACTCAAgAgCA-3’

　　 R：5’-AgAggCCTATCACAgCCATCAAg-3’

　　 MyD88 F：5’ -TATACCAACCCTTGCACCAAGTC-3’

　　R：5’ -TCAGGCTCCAAGTCAGCTCATC-3’

　　TLR4 F：5’ -CTCACAACTTCAGTGGCTGGATTTA-3’

　　 R：5’ -GTCTCCACAGCCACCAGATTCTC-3’

　　积的影响 与正常对照组比较，模型组在造模后不同 时间点大鼠足趾容积显著增大，差异有统计学意义 （P＜0.05）；与模型组比较，在造模后 2 h 与 6 h，虎 杖 -桂枝低、中剂量药对组大鼠足趾容积显著减小， 差异有统计学意义（P＜0.05）；造模后 48 h 与 72 h 虎杖 -桂枝药对低、中、高剂量组大鼠足趾容积均 显著减小，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。

　　表 2 各组对急性痛风性关节炎大鼠不同时间点足趾容积率的比较（x ± s，n=8）

　　 Table 2 Effect of herb pair Huzhang -Guizhi on the digital volume of rats with acute gouty arthritis induced by sodium urate at different

　　times

　　组别

　　剂量 / g·kg-1

　　足趾容积率 /%

　　0 h

　　2 h

　　6 h

　　24 h

　　48 h

　　72 h

　　正常对照组

　　2.09±0.06

　　2.12±0.06

　　2.070±0.08

　　2.092±0.06

　　2.099±0.06

　　2.100±0.08

　　模型组

　　2.14±0.08

　　3.24±0.53*

　　3.361±0.66 *

　　3.692±0.65*

　　2.664±0.31*

　　2.470±0.24*

　　秋水仙碱组

　　0.1

　　2.05±0.14

　　2.65±0.47▲

　　2.779±0.64▲

　　3.130±0.53

　　2.348±0.28▲

　　2.282±0.15▲

　　虎杖 -桂枝低剂量组

　　3.5

　　2.05±0.12

　　2.77±0.52▲

　　2.980±0.48▲

　　3.107±0.59

　　2.456±0.26▲

　　2.313±0.17▲

　　虎杖 -桂枝中剂量组

　　7

　　2.10±0.13

　　2.75±0.39▲

　　2.890±0.59▲

　　3.086±0.47

　　2.404±0.35▲

　　2.275±0.24▲

　　虎杖 -桂枝高剂量组

　　14

　　2.04±0.15

　　3.09±0.44

　　3.353±0.50

　　3.517±0.49

　　2.544±0.31▲

　　2.352±0.18▲

　　注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

　　2.2 滑膜组织学变化

　　见图 1。正常对照组膝关节软

　　膜细胞呈灶性增生，炎细胞弥漫性浸润，浸润的细胞

　　 组织未见异常，滑膜组织光滑完整，软组织内可见正 主要为中性粒细胞﹑淋巴细胞。各给药滑膜及周围软常血管，纤维结缔组织无炎细胞浸润。模型组滑膜及 组织内见少量 -中等量炎细胞浸润，部分小血管扩周围软组织广泛充血﹑水肿，表面有纤维素粘附，滑 张充血，间质纤维组织增生。参考文献标准[9]对滑膜

　　 A. 正常对照组 B. 模型组 C. 秋水仙碱组 D. 虎杖 -桂枝低剂量组 E. 虎杖 -桂枝中剂量组 F. 虎杖 -桂枝高剂量组

　　图 1 大鼠关节滑膜组织病理图（200×）的病理染色结果进行判断，模型组滑膜衬里增生、血 （P＜0.05，P＜0.01）；虎杖 -桂枝高剂量组在改善滑管充血、纤维素沉积、滑膜组织内炎症细胞浸润情况 膜衬里增生方面效果明显，与模型组比较，差异有统和总积分值均明显增加，与正常对照组比较，差异有 计学意义（P＜0.01）；虎杖 -桂枝低、中剂量组在改统计学意义（P＜0.01）；虎杖 -桂枝低、中、高剂量 善纤维素沉积方面效果明显，与模型组比较，差异有组血管充血、滑膜组织内炎症细胞浸润和总积分值均 统计学意义（P＜0.05）。见表 3。

　　有显著降低， 与模型组比较， 差异有统计学意义

　　表 3 各组对滑膜组织的影响（x ± s，n=8）

　　Table 3 The impact of herb pair Huzhang -Guizhi on synovium of rats in different groups

　　组别

　　剂量 /g·kg-1

　　滑膜衬里增生

　　血管充血

　　纤维素沉积

　　滑膜组织内炎症细胞浸润

　　总积分

　　正常对照组

　　0.00±0.00

　　0.33±0.52

　　0.00±0.00

　　0.33±0.52

　　0.67±1.03

　　模型组

　　1.67±0.52**

　　2.00±0.00**

　　1.33±0.52**

　　2.83±0.41**

　　7.83±1.33**

　　秋水仙碱组

　　0.1

　　0.33±0.52

　　0.83±0.41▲▲

　　0.50±0.84▲

　　1.33±1.03▲▲

　　3.00±2.00▲▲

　　虎杖 -桂枝低剂量组

　　3.5

　　1.17±0.75

　　0.83±0.41▲▲

　　0.50±0.84▲

　　1.83±0.98▲

　　4.33±2.16▲▲

　　虎杖 -桂枝中剂量组

　　7

　　0.43±0.53

　　0.86±0.69▲▲

　　0.43±0.53▲

　　1.29±0.49▲▲

　　3.00±1.00▲▲

　　虎杖 -桂枝高剂量组

　　14

　　0.14±0.38▲▲

　　0.86±0.38▲▲

　　0.57±0.53

　　1.43±0.53▲▲

　　3.00±1.41▲▲

　　注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05 ，▲▲P＜0.01。

　　2.3 药对虎杖-桂枝对急性痛风性关节炎大鼠血清IL-1β、TGF-β 含量的影响 与模型组比较，虎杖 -桂枝低、中、高剂量组大鼠血清 IL-1β 表达量显著降 低，差异有统计学意义（P＜0.01）；虎杖 -桂枝药对各剂量组 TGF-β 含量有所升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）

　　见表 4。

　　表 4 各组对大鼠急性痛风性关节炎血清 IL-1β、TGF-β 含量 的影响（x ± s，n=8）

　　Table 4 The impact of herb pair Huzhang -Guizhi on IL-1β and TGF-β in the serum of acute gouty arthritis rats

　　组别

　　剂量 /g·kg-1

　　IL-1β/pg·mL-1

　　TGF-β/pg·mL-1

　　正常对照组

　　17.11±3.86

　　71265.36±8516.58

　　模型组

　　142.74±15.44**

　　71118.25±9865.50

　　秋水仙碱组

　　0.1

　　23.55±8.99▲▲

　　103463.84±23942.53▲

　　虎杖 -桂枝低剂量组

　　3.5

　　104.12±17.08▲▲

　　77454.98±7473.41

　　虎杖 -桂枝中剂量组

　　7

　　49.86±12.55▲▲

　　78533.15±8279.73

　　虎杖 -桂枝高剂量组

　　14

　　88.22±14.24▲▲

　　77035.92±6598.75

　　 注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，▲P < 0.05，▲▲P < 0.01。

　　2.4 虎杖-桂枝药对对痛风性关节炎外周血 TLR2、 TLR4 及 MyD88 基因表达量的影响 模型组大鼠外 周血 TLR2、TLR4 及 MyD88 基因的表达水平显著升 高，与正常对照组比较， 差异有统计学意义（P＜0.01）。虎杖 -桂枝药对各剂量组大鼠外周血 TLR2、 TLR4 及 MyD88 的表达水平显著降低， 与模型组比 较，差异有统计学意义（P＜0.01）。虎杖 -桂枝中 剂量组对 MyD88、TLR4 表达的抑制作用与秋水仙碱组作用相近，差异无统计学意义（P＞0.05），

　　3.5

　　3

　　**

　　**

　　**

　　正常对照组

　　2.5

　　模型组

　　2

　　▲▲#

　　▲▲#

　　▲▲#

　　秋水仙碱组

　　▲▲#

　　▲▲#

　　1.5

　　▲▲#

　　▲▲#

　　虎杖 -桂枝低剂量组

　　▲▲

　　▲▲ ▲▲

　　▲▲ ▲▲

　　1

　　虎杖 -桂枝中剂量组

　　0.5

　　虎杖 -桂枝高剂量组

　　0

　　TLR2

　　MyD88

　　TLR4

　　 注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，▲▲P＜0.01；与秋

　　 水仙碱组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。

　　 图 2 各组对大鼠急性痛风性关节炎 TLR2、MyD88、TLR4 表达的影响（x ± s，n=8）

　　Figure 2 The impact of herb pair Huzhang -Guizhi on the expression of TLR2、MyD88、TLR4 of acute gouty arthritis rats

　　 3 讨论

　　中药药对是根据药性配对，药物间相互作用以达 到更好疗效的配伍形式，是方剂的重要组成部分。研究中药药对的作用，有利于掌握用药规律，阐明中药 复方的作用机制。虎杖微寒，可清热利湿﹑解毒，散 瘀止痛；桂枝辛温通络，且反佐制约苦寒伤阳凝瘀之 弊。因此，我们复制大鼠急性痛风性关节炎模型，研 究药对虎杖 -桂枝对大鼠踝关节肿胀度以及对细胞 因子IL-1β、TGF-β 及 TLR2、TLR4/MyD88 信号的影 响，结果发现，虎杖 -桂枝药对可抑制痛风性关节炎大鼠关节肿胀度，降低 IL-1β 含量、下调 TLR2 TLR4、MyD88 的基因表达，减轻炎症反应。 本实验研究采用经典的 MSU 注射大鼠踝关节造模方法，该方法会出现大鼠关节红肿、发热疼痛，行 走不便，具有急性痛风的特征。给予不同剂量的虎杖 -桂枝药对后，大鼠关节的肿胀度明显缓解。病理学 研究也发现，不同剂量的中药药对虎杖 -桂枝可减 少关节滑膜炎症、细胞浸润和血管充血。痛风是 MSU 结晶引起的炎症反应，细胞的炎症级联反应通 常是与单核巨噬细胞的刺激和活化而产生的炎症介质 有关，其中，包括 IL-1β，肿瘤坏死因子（TNF-α）， IL-6 等，研究已经证实 IL-1β 是单核细胞的细胞系 产生的最重要的促炎细胞因子，并且 IL-1β 的产生 是急性痛风性炎症发病的必要物质[10-11]。转换生长因 子 β 受体（TGF-β）对细胞的生长、分化和免疫功能 都有重要的调节作用， 其中， TGF-β1 又可抑制 IL-1、IL-6 的合成与致炎活性。急性痛风炎症发病 期间，IL-1β 的含量显著性增加，后期 TGF-β1 的含 量上调诱导痛风的自发缓解，通过多个方面抑制炎症反应也得到了验证。本实验结果表明，不同剂量的 虎杖 -桂枝药对均可不同程度的降低 IL-1β 的含量， 减轻机体炎症反应的作用。

　　Toll 受体（TLRs）是先天免疫的识别受体，能够识 别 PAMPs 和损伤相关分子模型（DAMPs），主要表达 于免疫细胞， 包括单核细胞、巨噬细胞和粒细胞 等[13-14]。TLRs 属于Ⅰ型跨膜蛋白受体，多数 TLRs 有 细胞质 Toll/IL-1 受体（IL-1R）域，它是激活下游信号 途径所需的部位，从而导致 NF-κB 的活化[6]，并诱导 炎症因子如 IL-1 和粘附分子等基因的表达，国外研 究[14-15]表明，IL-1β 的产生确实与 TLR4 的激活有关。 髓样分化因子 88（MyD88）是一种转接蛋白，TLRs 通 过 MyD88 依赖性途径或 MyD88 非依赖性途径进行信 号传递，识别入侵病原体，激活天然免疫，其中， TLR2 是由 MyD88 依赖性途径介导的；TLR4 可同时 经过 MyD88 和 TRIF 两条途径进行信号传导，MyD88 在 MSU 产生免疫反应中是必不可少的转接蛋白[11-15]，

　　此通路在炎症发病中具有重要作用。本实验结果显 示：模型组 TLR2、TLR4、MyD88、IL-1β 表达量均 显著性增高，可激活 TLRS/MyD88 信号通路，促使 IL-1β 的合成释放，增强机体的炎症反应。各给药组 均能不同程度下调 TLR2、TLR4、MyD88 的表达量而 减少 IL-1β 的表达量，抑制机体的炎症反应。

　　药对虎杖 -桂枝对痛风性关节炎大鼠模型急性炎症有明显的抑制作用，可缓解关节肿胀，减少关 节滑膜炎症细胞浸润反应和血管充血。其作用可能 是通过抑制 IL-1β 的分泌， 抑制炎症过程中的 TLR2、TLR4/MyD88 信号通路，减少炎症因子的生 成。TLRs/MyD88 信号通路是治疗痛风一个非常有前 景的靶点，为后续探讨中药治疗痛风作用奠定了基 础。

　　来源：北京众实迪创科技发展有限责任公司

　　联系电话：400-016-4066（免费电话）；010-85376599

　　E-mail：zhongshi1118@126.com