优化Benzonase®核酸内切酶在病毒产品纯化中的应用

生物制药生产中去除DNA的明智选择——优化Benzonase®核酸内切酶在病毒产品纯化中的使用
 
 
Benzonase®核酸内切酶——生物制药生产中去除DNA的明智选择，其价值已在过去的30多年里予以了证明。使用Benzonase®核酸内切酶的生产遵循GMP (ICH Q7)，从而提供了高质可靠的产品，以此平衡工艺的高效性和法规的要求。所有Benzonase®核酸内切酶产品具有相同的核酸序列（经LC-MS/MS质谱分析证实）、稳健性和活性。
 
作为一种没有碱基偏好性的核酸内切酶，它们可以将DNA和RNA降解为3到5个碱基对(<6 kDa)的小片段，是监管机构要求的病毒载体和疫苗生产中去除核酸的理想工具。使用Benzonase®核酸内切酶可进一步增加病毒纯化的收率，保护下游层析和过滤装置不受污染，并且降低料液粘度。
 
为什么要优化Benzonase®核酸内切酶在生产工艺中的使用？
 
Benzonase®核酸内切酶是一款高质量产品，可为工艺带来巨大价值。关键在于要以较经济的方式使用它。由于Benzonase®核酸内切酶活性在很大程度上受到其所应用基质环境的影响，故其应用优化应当是工艺开发中必不可少的关键步骤。
 
在本方案中，我们将提供如何规划和建立Benzonase®核酸内切酶实验设计（DoE）优化实验的指引。请注意，虽然在本方案中并未涉及Benzonase®核酸内切酶使用点（如在生物反应器中、细胞裂解后或澄清后操作）的优化，但就整体优化而言，则也应予以考虑。
 
优化流程
1、DoE介绍
实验设计(DoE)是指利用统计学规划、实施和分析多个因子对一个或一组参数的影响。DoE是一种强大的工具，可用于各种实验情况，如优化酶的反应条件。为Benzonase®核酸内切酶的应用建立DoE，有助于找到最佳操作条件，达到工艺中所需的DNA清除率。
 
2、DoE设计
为了建立符合DoE概念的实验系列，建议首先定义常数因子、具有中心点起始条件的输入变量和输出参数。
 
① 定义常数因子
✦需已知样品材料的平均DNA载量，用于计算所需酶量；
 
✦由于病毒生产上游工艺的材料成分复杂，应用也各不相同，但Benzonase®核酸内切酶的优化目标是一致的。因此，可将其视为常数因子，以及由培养环境产生的pH值和盐浓度也可视为常数因子。有关不同化学品对Benzonase®核酸内切酶性能的影响概述，请参考我们的产品手册；
 
✦由于Mg2+浓度是Benzonase®核酸内切酶发挥作用的最关键参数，因此应始终保持2mM的常量；
 
✦培养容器和混合工艺过程应始终保持不变。
 
② 定义输入变量
平衡Benzonase®核酸内切酶的作用效果取决于：
 
✦Benzonase®浓度
✦孵育时间
✦孵育温度
 
③ 定义输出
由于Benzonase®核酸内切酶应用的目标是DNA消化，因此关键输出为：
 
✦DNA含量>100 bp片段
✦产品完整性
 
3、已定义变量的中心点起始条件
建议设置以下起始点：
 
✦孵育时间设置为2个小时
✦孵育温度设置为室温，如21°C
 
Benzonase®核酸内切酶在标准测定条件下的理论浓度，根据下列公式，基于各样品材料的DNA含量得出：

Benzonase®核酸内切酶用量应当基于随产品提供的COA给定的实际活性（单位为U/µL）而定。
 
4、DoE实验方案
 
下表建议Benzonase®核酸内切酶优化实验设置的第一种方法。这种方法选择三种温度条件，分别为37°C、室温和4°C，同时选择1、2、6个小时的三种典型培养时间。结合三种Benzonase®核酸内切酶浓度，是理论浓度的x倍。
 

▲表一：建议实验设计
 
5、检测Benzonase®核酸内切酶效力
 
基于Benzonase®核酸内切酶的DNA消化应当使用宿主细胞DNA的100- 200碱基对片段的特定qPCR方法进行监测。完整的DNA经过Benzonase®核酸内切酶消化后降解成3到5个碱基对的片段，限制荧光DNA嵌入染料测定的效用，后者可检测小至4个碱基对的DNA片段。建议选择合适的对照实验来确定消化工艺过程，从而确保稳健的结果。
 
DoE结果和后续步骤说明：
上表中建议的实验设计是根据影响DNA/RNA消化的主要参数提出的建议。可根据您当前的资源，减少试验次数或者增加更多的条件。一旦执行设计，建议首先证实生成数据是否与最初实验假设相一致。然后充分分析和解释结果。这可能需要进一步的试验或基于缩窄围绕已确定最优值的参数值范围再进行DoE。此外，应考虑对生产工艺过程中的使用点（如在生物反应器中、细胞裂解后或澄清后）进行优化，以实现Benzonase®核酸内切酶最具经济性的表现。
 
适用于GMP生产的Benzonase®：