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全基因组测序各步骤工具

2021.7.01

全基因组测序（WGS）是下一代测序技术，用于快速，低成本地确定生物体的完整基因组序列。基因组的深度测序对于临床研究的意义重大，解读WGS数据并了解基因组突变在健康和疾病中的重要性是精准医疗的基石。

WGS分析流程能分为三大块，数据处理、检测变异和综合分析，具体如下图所示：

由于WGS现在已经非常成熟了，因此这里面的每一步骤都能在网上找到相应的工具。

质量控制

在高通量测序中，有时候会出现低质量读数和污染读数等问题，会影响接下去的分析结果。因此，质量控制（QC）对于原始NGS数据至关重要。现在质量控制软件主要用的是 NGS-QC Generator，它可以从与特定NGS概况相关联排序读数的分布推断出质量指标。

基因组对齐

高通量测序分析中需要将生成的读数对准（映射）到参考序列。此时，就需要用到Bowtie和BWA。前者能以每小时超过2500万个35 bp读数的速率将短DNA序列（读取）与人类基因组进行比对。后者针对大型参考基因组（如人类基因组）绘制低分歧序列。

序列可视化

可视化读取对齐是使用现有数据验证候选结构变体（SV）的最有效方式。这可以用IGV来完成。高性能的查看器可以有效地处理大型异构数据集，同时在所有基因组分辨率级别提供直观的用户体验。IGV的一个关键特征是其关注于基因组研究的综合性质，支持基于阵列和下一代测序数据，以及临床和表型数据的整合。

变异检测

都是各种基因变异的检测手段，就放一起说了。种系突变、体细胞突变和插入缺失检测这三个的检测都可以用一个软件，SAMtools。这是用于与高通量排序数据进行交互的程序。它可以处理SAM / BAM / CRAM格式的读取，写入，编辑，索引，查看和转换SAM / BAM / CRAM格式。SAMtools还可以索引FASTA格式的引用序列或从索引引用序列中提取子序列。

拷贝数变异（CNV）是遗传变异的常见来源，涉及许多基因组障碍。CNV是基因组中结构变异（SV）的一种形式。通常，CNV是指大于1kbp的DNA片段的重复或缺失。CNV检测可以用CNVnator，它可以从家族和群体基因组测序中发现基因型、表征典型和非典型CNV的方法。CNVnator具有灵敏度高（86％-96％），假阳性低（3％-20％），基因分型准确率高（93％-95％）的特点。

短串联重复序列（STR）是DNA重复的一种，重复单位为2-6bp，重复次数10~60多次，基因片段，400bp以下。STR是存在于人类基因组DNA中的一类具有长度多态性的DNA序列，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而呈现出长度多态性，通常多态性片段长度在100-300bp。

STR的长度变异性与许多物种的表型变异有关，一些疾病也是由重复扩张引起。分析STR，特别是长STRs的变化是理解其个体变异性和导至其不稳定的机制的重要步骤。

检测STR比较简单，不用下软件，直接在线操作。用MISA-web (http://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/) 中的MIcroSAtellite identification tool可以通过在输入字段中指定相应的登录号来从NCBI数据库中检索序列。MISA-web支持两种不同的输出格式：专有的MISA输出格式和通用GFF3。GFF3输出格式有助于将MISA网页搜索结果集成到下游分析中。

功能预测

现代测序技术产生越来越详细的基因组变异数据。然而，鉴于许多疾病性状复杂，是多基因联合作用，将单个变体或突变基因与表型相关联的常规方法已有其局限性。做功能基因预测的工具就比较多了。

第一个在线工具是MutationTaster (http://www.mutationtaster.org/)。这个免费的在线应用可以快速评估DNA序列改变的致病潜力。

MutationTaster集成了来自不同生物医学数据库的信息，并使用已建立的分析工具。分析包括进化保守，剪接位点变化，蛋白质特征的丧失和可能影响mRNA量的变化。然后通过一个贝叶斯分类器评估测试结果，该分析器预测疾病潜力，一般的查询在0.3秒内就可完成。

第二个网站是SNPdryad（http://snps.ccbr.utoronto.ca:8080/SNPdryad/ ），可预测在人类蛋白质中氨基酸取代会发生的有害作用。而且在准确预测有害nsSNP方面，SNPdryad优于其他算法。

第三个是个数据集，dbNSFP（https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP），为人类非同义单核苷酸变体（nsSNV）和剪接位点变体（ssSNV）的功能预测和注释提供一站式资源，还有从外显子中发现的大量SNV筛选和测序研究。dbNSFP创建了基于人类参考序列的所有潜在nsSNV和ssSNV的列表，并为每个SNV编译了功能预测和注释。

目前该数据集中包括82,832,027 个nsSNV和ssSNV，附加的数据库dbscSNV编译所有潜在人类SNV及其有害性预测，另外增加了的15,030,459个潜在功能SNV。

驱动突变

区分驱动突变与偶发突变对于了解致癌分子机制，以及鉴定预后和寻找治疗靶标至关重要。MutSig可以分析在DNA测序中发现的突变列表，以便识别基因突变是驱动突变还是偶发突变。该软件最初是用于分析体细胞突变，但也可用于分析种系突变。MutSig建立了在肿瘤形成期间突变过程的模型，分析每个基因，以鉴定比预期突变更频繁的基因。

变异注释

最新的测序仪器与SNP发现工具结合可用于识别大量可能的SNP，而在识别后的下一个问题就是注释和选择功能重要的SNP。这项任务也能用dbNSFP完成，不过更推荐用ANNOVAR。它可以利用不断更新的信息来注释不同基因组（包括人类基因组hg18，hg19，hg38以及小鼠，蠕虫，蝇，酵母和许多其他基因组）检测到的遗传变异相关功能。ANNOVAR可以在一天内处理数百种人类基因组。