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手性色谱柱——蛋白质型

2018.3.27

   蛋白质型手性色谱柱属于第5种类型。分离依赖于疏水相互作用和极性相互作用。已经有多种蛋白质用于此类手性色谱柱。目前使用较多的是α-酸性糖蛋白(α-Acid Glycoprotein,AGP),人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA),牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)和卵类粘蛋白(Ovomucoid,OV)。

  α-酸性糖蛋白分子由181个氨基酸残基和40个唾液酸(sialic acid) 残基构成。α-酸性糖蛋白分子偏酸性,等电点为2.7。含有两个二硫键,性质很稳定。α-酸性糖蛋白分子可以共价键合到硅胶上,制成手性色谱柱,可以分离许多化合物。

   α-酸性糖蛋白手性色谱柱使用的流动相通常为pH 4-7的磷酸盐缓冲液和很小比例的有机相。有机相首选异丙醇,如达不到分离要求,可以尝试乙腈,乙醇,甲醇或四氢呋喃。有机相的改变导致蛋白结构发生暂时的改变。色谱柱的负载量至关重要,典型的负载量为0.02mg/ml的浓度样品,进样20μl。pH 的改变对手性选择性起关键作用,尤其是胺类化合物。pH降低导致蛋白质负电荷的降低,引起胺类化合物保留时间减小,然而这意味着可以减小有机相比例,使选择性增加,峰形改善。

   通过调节有机相比例仍无法达到分离效果时,有时需用电荷调节剂。但这可能引起蛋白结构的永久改变,这些电荷调节剂包括丁酸、辛酸、癸酸和二甲基辛胺。有时也用到1,2 亚乙基二醇,1,2丁醇和氯化钠。温度对分离也有影响,温度增加保留时间,减小分离因子。

  人血清白蛋白(HSA)分子量为69,000,等电点为4.8。蛋白中认为存在两个药物结合位点:华法令-氮杂普鲁帕宗(warfarin-azapropazone) 和苯基二氮杂-吲哚(benzodiazapine-indole)结合位点。流动相中加入辛酸,采用人血清白蛋白手性色谱柱可以有效分离benzodiazapine。Warfarin 和oxazepam也用人血清白蛋白手性色谱柱得到了分离,流动相组成为:100mM磷酸缓冲液pH7:乙腈:异丙醇 = 84:10:6。

   牛血清白蛋白(BSA)为球型蛋白,分子量为66,000,等电点为4.7。此蛋白为一个单氨基酸链,通过17个二硫键形成9个双环。许多化合物通过牛血清白蛋白手性色谱柱得到分离。牛血清白蛋白不如α-酸性糖蛋白稳定,一些有机溶剂(如乙腈、甲醇)可使蛋白变性,因此使用起来要特别注意。

   卵类粘蛋白由蛋清中提取,分子量为55,000。它可分离大量的胺类和酸类化合物。

   蛋白手性色谱柱的载样量均较小。影响了蛋白手性色谱柱在制备色谱中的应用。

   蛋白手性色谱柱在所有手性色谱柱中是应用最广的色谱柱,但并不是效果最好的色谱柱。

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