重组DNA分子导入原核细胞及PCR检测
一、目的与意义
学习使用大肠杆菌感受态细胞导入外源DNA，使学生掌握DNA分子进入细胞的原理和实验操作技术; 掌握PCR法快速鉴定重组载体的基本操作。
二、实验原理
转化是指将质粒DNA或构建的重组子导入细胞的过程。细菌细胞在低温，低渗（CaCl2溶液）中膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成了抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。经42℃短时间热激处理后，促进了细胞吸收DNA复合物。重组质粒转化宿主细胞后，还需要对转化菌落进行筛选鉴定，通过α互补进行筛选是最常用的鉴定方法之一。
目前实验使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β-半乳糖苷酶的启动子及其编码α肽链的DNA序列，此结构称为lacZ基因。lacZ 基因编码的α肽链与失去正常氨基末端的β半乳糖苷酶突变体互补，产生具有功能活性的β半乳糖苷酶分子，这种现象称为α互补。在IPTG（异丙基硫代β-D-半乳糖苷）的诱导下，β半乳糖苷酶能将X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带lacZ基因的质粒载体转化到β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，都会在涂有IPTG和X-Gal的培养基平板上形成蓝色菌落。当有外源DNA片段插入到位于lacZ中的多克隆位点后，就破坏了α肽链的阅读框，从而无法形成α互补，不能产生具有功能活性的β-半乳糖苷酶，因此含有外源DNA片段的重组子的克隆在涂有IPTG和X-Gal的培养基平板上是白色菌落。
PCR法快速鉴定重组载体的基本原理是直接用菌液为摸板，通过特异引物的扩增来鉴定外源片段是否重组。
三、实验仪器 PCR技术讨论版 http://bbs.bbioo.com/forum-143-1.html
| 电泳仪4台（8人1台） | 微波炉 |
| 移液器16套（每2人1套） | PCR仪 |
| 水平电泳槽8套（每四人1套） | 超净工作台（4人1台） |
四、实验材料
1、1.5 ml离心管
2、无菌枪头20 μL各2支
3、PCR管
五、实验试剂
1、溴酚兰加样缓冲液（6×）: 溴酚兰0.25%，蔗糖40%
2、溴化乙锭（10 mg/ml）
3、5×TBE：Tris 碱54 g，硼酸27.5 g，EDTA-Na2·2H2O 4.65 g，加ddH2O 至1000 ml。高压湿热灭菌20 min，4℃保存备用。用前稀释至0.5×。
4、PCR所用试剂同
5、dNTP Mix (上海生工)
6、Taqase plus（北京鼎国）
7、模板DNA：20 ng/µL
8、引物（委托上海生工合成，经离心，用无菌ddH2O稀释成20 nmoI/L
| CHSUP2 | 5’-GCGGAATTCATGGTGATGTGTACACCGTC-3’ |
| CHSDN2 | 5’-GGCAAGCTTTTAGAGAGGAACGCTGTGC-3’ |
9、10×Taqase plus缓冲液
10、无菌ddH2O
