快速识别食品中的细菌

食物很容易被细菌感染，进而对人类的健康造成威胁。因此，对这种污染的控制就显得十分重要。在这方面，拉曼光谱仪提供了一种简单而又灵敏的方法。

目前，对细菌带来的食品污染的检测大部分还依赖于微生物学的分析方法，或者是通过聚合酶链式反应（PCR）实现的。利用微生物学进行的识别是以细菌对所提供的不同营养物质所发生的作用为基础的。通过选择的营养媒介，可以对这种作用进行检测。因此，通过试剂可以显示出不同成分存在或不存在于介质当中。如果一种细菌正在作用于培养介质中的一种确定成分，那么可以通过色彩的突变来显示出这种细菌。通过与营养介质的适当结合，就可以推论出相应的细菌种类。根据聚合酶链式反应，可以分离出细菌的DNA，并且可以复制出特殊基因组序列。另外再通过DNA捕捉设备以及一台标记装置，就可以鉴定出细菌种类。虽然这种检测方法十分专业，但仍有不足之处，即在通常情况下，必须要有用于识别的大量的同一种类细菌。出于这个原因，预先进行细菌培养的试验就显得十分必要，而根据细菌的种类，这个试验将需要花费几个小时甚至几天的时间。

拉曼光谱仪的应用

通过使用拉曼光谱仪进行细菌识别是一种不同的方法。通过拉曼光谱仪，可以检测出分子的特征电磁波。每个分子都有一个完全属于自己的特征光谱，这些光谱非常清晰明了，工作人员在谈起这些光学指纹时都会显得很兴奋。通过一套显微拉曼设备的应用，包括一台拉曼装置和一台显微镜，就可以从亚显微测量计范围内的一个空间获取信息，因而使测量单个细菌细胞的拉曼光谱成为可能。图1是单个细菌在532nm激光波长上的拉曼光谱图谱范围内的图片，可以识别出单个分子级别的拉曼谱带。其中蛋白质（有机化合物-I、有机化合物-III和苯基丙氨酸）和DNA的拉曼谱带是非常突出的。

图1.  一个单独的细菌细胞在532nm波长处的拉曼光谱。

由于不同的细菌种类在它们的细胞生物化学成分方面有所不同，因而根据它们的拉曼光谱就可以分辨出细菌的种类。这种方法非常大的好处就是，可以测量单个细菌。因而可以略去微生物技术中的提炼步骤，从而可以节省大量的时间。

牛奶中的细菌检测

拉曼光谱仪还可用于牛奶中的细菌污染检测，不同物质如碳酸钙、牛奶蛋白、淀粉、牛奶脂肪或乳糖，都有各自清晰的光谱。因为在细菌当中也发现了牛奶所具有的一些成分，因此必须要找到一种方法，能够将细菌从牛奶的残留物中分离出来。图2的左图显示，对受到污染的牛奶进行测定时，在显微镜下拍摄到的图片。在这里，对细菌进行定位是非常重要的，这是因为蛋白质聚集或者脂肪微粒也是以相似的方式和大小形成的，在这样的一个基体中，可以对细菌进行可视荧光染色。这里使用的是着色剂，它们会有选择地与细菌相结合。通过染色，一些特别的细胞就会被着色，与此相反，非生物微粒会保持不变。图2的右图显微镜图片中，显示的是同一区域拍摄的荧光图片。在这里，细菌发绿光（用圆圈标记）。并且在亮度高的区域拍摄到的图片中，相似的颗粒也会被标注出来。我们知道，如果只是基于形态学，做到这样的区分是不可能的。另外，如果是在一个干净的局部区域，还可能区分出活的和死的细菌。这个染色技术使用了两种荧光着色剂。一种着色剂只对活细菌进行染色，而另一种着色剂只对死细菌染色。不过，这种对细菌进行荧光标记还是有不足之处，拉曼光谱对荧光是非常敏感的，因而当一些不同等级的荧光比拉曼强度更强时，它会被掩盖住。为了在荧光标记的细菌上获得不受任何影响的拉曼光谱，必须要遵循几个前提条件，即拉曼的激光波长必须被转移或翻转至光谱范围当中，并且在荧光吸收范围之外。

图2.  借助荧光染色对牛奶中的细菌进行定位（左图，透射光图片；右图，荧光图片）。

图3显示的是球形杆菌和苏云杆菌孢子的拉曼光谱。这样，天然孢子的拉曼光谱就可以与这些来自牛奶或者说是来自牛奶脂肪的细菌孢子进行比较。乍一看，几乎无法对这些孢子各自的拉曼光谱进行区分，然而它们与无污染牛奶光谱的区别是显而易见的。为了能够更好地对这些光谱进行比较，可以进行相似性计算。图3右图显示的是拉曼光谱经过等级划分的一个分群抽样分析树形图。在图中，每条水平线表示一个光谱，根据它们在不同方位的相似性，通过垂直线把它们彼此相互连接起来。而这种相似性在距离间隔方面是具有不均一性的。

图3.  拉曼光谱仪对牛奶中的细菌进行识别（左图，不同种类杆状菌的拉曼光谱与牛奶的拉曼光谱之间的比较；右图，利用有等级分别的分组抽样法对拉曼光谱进行分类）。

两个拉曼光谱越不相似，不均一性的程度就越大。在树形图中，大的一群细菌光谱清楚地分为两个独立的苏云杆菌和球形杆菌的拉曼光谱群。不过在这些光谱群里，不再能够区分出哪个是天然的内生孢子，哪个是从牛奶中分离出来的内生孢子。很明显，利用微拉曼光谱仪可以在不必进行培养的前提下对单独的细菌进行分类。

自动识别

为了在食物，如牛奶中对陌生细菌进行识别，必须建立一个基本而且更加广泛的数据库。为此，开发出了一台自动显微拉曼装置，它可以实现在更短的时间内对大量细菌数目进行分析（图4）。这个工具可以生成对应于不同食物基本成分的一个拉曼光谱仪数据库，利用该数据库就可以对细菌引起的污染进行识别，而不必预先培养。 

图4.  用于细菌定位和识别的自动显微拉曼光谱仪。

作者简介

Susann Meisel，在耶拿FSU大学物理化学系教授办公室指导下攻读博士；工作内容：采用拉曼微摄谱仪对微生物进行研究。

Petra Rösch，在耶拿FSU大学Jürgen Popp教授的工作组从事科研工作；工作内容：对用于生物学、医学和药物检测的电磁波光谱仪进行分析和特性研究。

 Markus Lankers，rap.ID公司创始人，负责公司的研究和开发工作。