试剂、试剂盒 液氮 研磨缓冲液TLE 缓冲液平衡酚)氯仿IiCl 溶液 (DEPC 处理）乙酸钠 (DEPC 处理） 无水乙醇DEPC 处理水

仪器、耗材 Folytron 匀浆器（BrinkmarmPT10 35)

实验步骤

一 材料与设备

1) 液氮

2) 研磨缓冲液 18mol/LTris，0.09mol/LLiCl,4.5 mmol/LEDTA,1%SDS，用 HC1 调 pH 至 8.2。此缓冲液与加了 1/10 体积 10%SDS 的 TLE 缓冲液相当

3)TLE 缓冲液平衡酚（TLE 缓冲液：0,2mol/LTris,0.lmol/LLiCl，5 mmol/LEDTA，用 HC1 调 pH 至 8.2)

4) 氯仿

5)8mol/L 和 2mol/LIiCl 溶液 (DEPC 处理）

6)3mol/L 乙酸钠 (DEPC 处理）

7) 无水乙醇

S)DEPC 处理水

9)Folytron 匀浆器（BrinkmarmPT10/35)

二 操作方法

1) 研钵和研杵先用液氮冷却，称出 15 g 冻结植物组织放置于研钵中 (加液氮保持冻结），用研杵磨成粉末，立即转移到一个盛有 150 mL 研磨缓冲液和 50 ml TLE 缓冲液平衡酚的 500 ml 烧杯中

2)Polytron 匀浆器，设定在 5〜6 档匀浆 2 min. 加人 50 ml 氯仿，并用勻浆器在低速下混句。将混合物移至 500 ml 离心瓶中，于 50℃ 加热 20 min

3) 于 4℃ 在 17700 g 下离心 20 min。将上层水相移至另一个干净离心瓶中界面保待后继步骤 4 处理），加入 50 mlTLE 缓冲液平衡酚，混匀，再加 50m 氯仿。

4) 将上步残余的水相连同界面 h 的物质移入一个 50 ml 离心管中，于 4℃12100 g 离心 20 min。

5) 吸出水相，与步骤 3 的水相及酚、氯仿混合物合并，剧烈混合。

6) 于 4℃17700 g 离心 15 min, 水相移入另一干净 500 ml 离心瓶。

7) 用 TLE 平衡酚反复抽提水相. 直至两相间界面干净为止，水相再以氯仿抽提。

8) 将水相移入 250 ml 离心瓶中，加入 LiCl 至终浓度为 2mol/L(加约 0.33 体积的 8mol/LLiCl) 在 4℃ 沉淀并过夜。

9) 于 4℃15300 g 离心 20 min，沉淀以 2〜3 ml2mol/LLiCI 溶液洗涤

10) 沉淀以 5 ml 水重溶，并移人 15 ml 离心管中，加人 LiCl 溶液至 2mol/L., 于 4°C 沉淀 RNA2 h 以上。

11) 于 4℃15300(¾离心 20 min, 用 2mol/LLiCl 溶液洗涤一次，重溶于 2 ml 水，加入200ul 3mol/L 乙酸钠溶液和 5.5 ml 无水乙醇，一 20℃ 沉淀过夜或在干冰/乙醇中沉淀 30 min

12) 于 4℃17700 g 离心 15 min 用 1 ml 水重溶沉淀。取 10ul 稀释至 lml 测 OD260 和 OD280。

注意事项

适于制备 RNA 的原材料 (如豌豆种子）15 g 即可获得 7 mg 总 RNA, 但 15 g 成熟的拟南芥原料可得总 RNA