3.2.2 单噬菌体克隆的鉴定

( 1 ) 从单克隆中制备噬菌体（或噬粒)。对噬粒，在 2 ml LB-Ap 上过夜生长一单菌落。混合 20 μl 培养液、2 ml LB-Ap  ( 和 IPTG，如愿意的话）和 1010 个/ml 辅助噬菌体 KO7。37°C 剧烈摇动保育过夜。对噬菌体克隆，用灭菌的牙签接触一单菌斑。将牙签放在 2 ml 含 100 μl 新鲜 XL-1 Blue 的 LB-Ap ( 和 IPTG，如果需要的话）中，37°C 剧烈摇动保育 6 h。按 3.1.1 和 3.1.2 节所述，制备噬菌体（或噬粒)。

( 2 ) 对每一个要测试的克隆，完成 3.2.1 节的第 （1 ) 和第 （2 ) 步，来准备一带有固定目标分子的小孔。同时用不含目标分子的涂渍溶液涂渍，来制备另一对照用小孔（见注6 )。

( 3 ) 加入 5 μl 5% BSA 溶液和 50 μl 从单克隆制备的噬菌体悬浮液到配体涂溃的和对照的小孔中。视相互作用强弱，调节噬菌体浓度（典型值：每孔 108~1011 个）。在搅拌 器上室温保温 2 h。

( 4 ) 用 TBST 冲洗 5 次。用喷水瓶在所有小孔中加入 TBST，然后清除液体，将平板翻转面朝下拍在一叠纸巾上。

( 5 ) 在每一个孔中，加入 50 μl 抗噬菌体-辣根过氧化物酶的抗体溶液（Phamacia; 在 TBST : BSA 中稀释1 : 2000)， 在搅拌器上室温保温 1 h。用 TBST 清洗 5 次。

( 6 ) 加入 50 μl 1step turbo-TMB (Pierce) ，等待约 10 min 直到蓝色显现，并加入 50 μl 2 mol/L 硫酸以终止反应 （ 使用有滤嘴的枪尖以保护移液器）。用平板读出器测量 OD450。选择对配体涂渍的小孔有高亲和力并对对照小孔呈低亲和力的克隆，以备进一步检测（测序、亲和力优化和蛋白质生产）。

3.3 酵母双杂交筛选

3.3.1 目标（“诱饵”）质粒的制备

在 pEG202 中克隆诱馆基因，使得诱饵与 LexA 在同一可读框表达。重要的是确认 LexA- 诱饵自己不激活报告基因，也不与野生型 FNfn10 相互作用。用相互作用交配法，这很容易测试 [13，19 ] 。

( 1 ) 用 LexA-诱饵质粒 [ 或 pEG202 作负对照，pBait (Origene) 作正对照 ] 和 pSH18-34 ( β-半乳糖苷酶报告质粒；Origene) 转化 RFY206，并在 YC Glc his- ura- 平板上选择。也 用 pYesTrp2 ( 激活子 B42 质粒；Invitrogen )、pTarget  (正对照；Origene ) 或 pYT45 转化 EGY48，并在 YC Glc trp-平板上选择。

( 2 ) 在 YC Glc his-ura- 平板上两个菌斑的每一个上用 LexA 质粒和报告质粒上平行划痕。在 YC Glc  trp - 平板用 B42 质粒以同样的方式划痕。30°C 保育两块平板 1~2 d。

( 3 ) 复制两块平板至一 YPD 平板。从两块板上来的划痕应该互相垂直，以使 EGY48 细胞和 RFY206 细胞在交叠处杂交。30°C 保育过夜。

( 4 ) 将 YPD 平板复制至 YC Glc leu- his- trp - ura、YC Glc his- trp- ura- 和  YC Gal Raf leu- his- trp - ura- 平板，并在 30°C 保育 3 d。所有杂交细胞应该在 YC Glc his- trp - ura- 平板上生长。在 YC Gal Raf leu - his- trp - ura- 平板上的生长指示“诱饵”和 “捕食者” 的相互作用。其他平板用于对照。

3.3.2 酵母双杂交库筛选

含有诱饵的 RFY206 与含有独体库的 EGY48 杂交，并选出含有独体和诱饵的细胞。酵母杂交的应用，使得可以有效地筛选多个库 [13] 。

( 1 ) 在 30°C，10 ml YC Glc his - ura- 培养基中，生长 16 h 驻有 pSH18-34 和 LexA-诱饵质粒的 RFY206。

( 2 ) 用 1.0 OD600= 2.0 X 107 个细胞/ml 换算，通过 OD600 测定细胞浓度。108 个诱饵细胞放在微离心管中以 10000 r/min 的转速在微离心机上离心 30 s，使细胞旋转沉降，用 200 μl 培养基让细胞悬浮。

( 3 ) 加入 107 个驻有独体的 EGY48 细胞到诱饵细胞中（见 3.1.7 )，并在 YP 平板上铺开。让细胞杂交 16 h。

( 4 ) 用 5 ml ( 每次用 1 ml)  YPD 培养基将细胞从平板上冲洗下来。100 倍稀释后测量 OD600，将 108 个细胞铺在 5 个 YC Gal  Raf  leu- his- trp - ura- 培养基平板上。于 30°C 保育这些平板 3~4 d。

( 5 ) 复制菌落到  YC Gal  Raf  leu- his- trp - ura- 培养基平板和 YC  Gal leu- his- trp - ura-培养基平板上。保育 16~24 h。真的正克隆将只会在 YC Gal  Raf  leu- his- trp - ura- 平板上生长。

( 6 ) 在通风厨内，打开平板盖，加入足够氯仿以覆盖板表面。5 min 后将氯仿倒入废物罐，并让剩余的氯仿挥发 10 min [ 20 ]。

( 7 ) 在微波炉内加热琼脂糖 -磷酸盐溶液（每皿 10 ml ) ，以溶解琼脂糖，在水浴中冷却到 50°C。在试管中加入 35 μl 50 mg/ml  X-gal 溶液和 10 ml 琼脂糖-磷酸盐溶液，搅拌，并倒入平板中。30°C 保育。观察颜色。挑出呈现蓝色的克隆以备进一步检验。

3.3.3 分离独体的特异性检测

( 1 ) 于 30°C，在 1.5 ml YPD 培养基中，培养从库中筛选出来的感兴趣的酵母细胞 16 h，并用 Y- DER 酵母 DNA 抽提试剂盒（Pierce) 从酵母细胞中制备 DNA。

( 2 ) 将透析后的酵母 DNA 用电穿孔注入大肠杆菌 KC8 细胞（见 3.1.4)，并在 LB-Ap 平板上挑选转化细胞。

( 3 ) 在基本 trp-Km 平板上复制菌落，并于 37°C 保育。选取两个菌落分别接种于 2 ml LB-Ap 培养基中，于 37°C，培养 10 h，并用标准方法抽提质粒 DNA。生长超过 10 h 的 KC8 细胞常产生不纯的质粒。用标准的 DNA 测序法测定独体片段的序列（见注 7 )。

( 4 ) 用 B42-独体质粒转化 EGY48，并用相互作用杂交法测定其与各种诱饵的相互作用（见  3.3.1)。

3.3.4 液相 β-半乳糖苷酶测试

生化测量之前，诱馆与独体的亲和力可用液相 β-半乳糖苷酶测试半定量地加以确定。这个方法比 3.3.2 小节描述的平板测试更为定量。我们改进了这个方法使之适用于 96 孔平板格式（见注 8 )。

( 1 ) 用 pSH18-34、LexA- 诱饵质粒（pEG202 的衍生物）和 B42 独体质粒 ( pYesTrp2 衍生物）转化 RFY206 酵母菌株。把一个菌落接种至 2 ml YC Glc his- ura-trp -，于 30°C 摇动过夜。

( 2 ) 稍稍离心以移除培养基，在温热的 YC Glc his- ura-trp- 中悬浮直至 OD600 值为 0.2。于 30°C 摇动 6 h。测 定 OD600 值并以每 350 μl 装入微离心管中。典型地，我们每次测量三遍。

( 3 ) 将 2 X β-半乳糖苷酶测试溶液与 Y-Per ( Pierce) 按 1 : 1 混合作为工作溶液。加 350 μl 工作溶液到每个样品中。多次翻转以混合。

( 4 ) 30°C 保育，同时检查颜色。当呈现黄色时，加 300 μl 0.5 mol/L 碳酸钠入离心管，并彻底混合。以最大速度离心微离心管 1 min。测定上清液的 OD420 值。

3.4 独体的克隆、表达、纯化和生物素化

当从库中筛选出具有所期望特性的独体后，其基因转染至大肠杆菌表达载体，独体则被表达纯化为一分离的蛋白质。我们在典型情况下每升培养液得到 10~15 mg 独体。我们也描述了为在免疫化学应用中便于探测而使独体生物素化的操作步骤。

3.4.1 独体的克隆

用寡核苷酸 NdeMetThrFNF(5'-CGGGATCCCATATGCAGGTTTCTGATGTTCCGACCGACCTGGAAGTTGTTGCTG-3'；它包含  Arg6 到 Thr 的突变）和 FNGKKGKR ( 5’-CCG ACTCGAGTTACTATTTACCTTTTTTACCGGTACGGTAGTTAATCGAG-3'），扩增感兴趣的独体基因，然后用 Nde I 和 Xho I 降解并克隆到用同样的酶降解过的 pET15b (Novagen) 中。通过测序确认表达载体中基因。

3.4.2 独体的表达

此操作步骤适合于 100 ml 培养液，对初步鉴定而言，这样的量应该能产生足够的独体。

( 1 ) 用独体表达载体转化 BL21 ( DE3 ) 细胞（Novagen) ( 见注 9) 。

( 2 ) 接种转化细胞至 10 ml M9-胰蛋白胨-Ap，并在强烈摇动下，于 30°C 保育 10~16 h。

( 3 ) 接种 2 ml 预培养液至预热的 100 ml M9-胰蛋白胨-Ap，并在强烈摇动下于 37°C 保育。当 OD600 值达到 0.7 时，加入 IPTG 至终浓度 0.5 mmol/L。

( 4 ) 在强烈摇动下于 37°C 保育 3 h 多，并离心收集细胞。细胞可存储于 -20°C，直至使用。

3.4.3 独体的纯化

此操作步骤适合于 100 ml 培养液（见 3.4.2 )。

( 1 ) 悬浮细胞沉淀于 6.4 ml pH 8.0 的 50 mmol/L Tris-氯化氢中。

( 2 ) 加入 64 μl  50 mg/ml 溶菌酶和 128 μl 50 mmol/L PMSF。混合并于 37°C 保育 15 min。超声破碎并悬浮直至不再有高度黏滞性。

( 3 ) 加入 910 μl 40 mol/L 氯化钠。于 4°C 以 27000 g ( 15000 r/min，SS34 转子）离心 10 min。收集上清液。

( 4 ) 将蛋白质溶液放入装载了  0.1 mol/L 氯化镍并用缓冲液 B 平衡过的 Hi-Trap 螯合柱中 （ 1 ml；Amersham-Pharmacia Biotech) 。先用  6 ml 缓冲液 B， 再用  6 ml 含 60 mmol/L 咪唑的缓冲液 B 洗柱。

( 5 ) 用 6 ml 缓冲液 C 洗脱独体。收集 0.5~1 ml 每份的洗脱液到微离心管中。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析洗脱液。

3.4.4 独体的生物素化

我们连接生物素到 Lys 的氨基。这虽然不是位点特异的，但在 C 端的扩展部分成团的 Lys 应该是最易发生的修饰位点。这个方法可用来连接其他的片段，如荧光染料。

( 1 ) 完成 3.4 3 小节中纯化操作的步骤（1 )~( 4 )。

( 2 ) 用 10 ml 缓冲液 D 清洗柱子。

( 3 ) 溶解 1 mg D-生物素- ε - 氨基己酸轻基琥拍酰亚胺脂（BoehringerMannheim) 于 50 μl 二甲基亚砜，并将其稀释至 3 ml 缓冲液 D 中。注射 1 ml 溶液到柱中并于室温黑暗中保温 1 h。再重复反应 2 次。

( 4 ) 用 6 ml 缓冲液 B 洗柱，并按 3.4.3 节第（ 5 ) 步所述洗脱独体。