实验方法原理 生化和免疫化学研究证明银染蛋白是RNA聚合酶I，其功能是催化rDNA转录rRNA形成核仁，因此通过这种反应能够特异显示rRNA转录的活性。

实验材料 HL-60细胞HeLa细胞

试剂、试剂盒 Carnoy固定液HCl甲酸AgNO3蛋白胶硫代硫酸钠戊二醛乙醇丙酮醋酸铀柠檬酸铅染液

仪器、耗材 显微镜电子显微镜超薄切片机水浴箱离心机天平染色缸平皿乳头吸管离心管擦镜纸

实验步骤

一、中期染色体核仁形成区的银染和观察

1.  取制备好的正常或肿瘤细胞染色体标本，直接放入装有5 N HCl溶液中，常温处理5分钟。

2.  用自来水反复冲洗几次，甩干，标本面朝上平放在平皿中。

3.  将0.1%甲酸临用前配制的50%AgNO，溶液约0.5 ml，用吸管滴在标本上，再盖上二片擦镜纸。

4.  放置平皿于56℃水浴中处理3~5分钟，待擦镜纸呈棕色后，取出标本用水冲洗、气干。

5.  镜检

（1）镜下所见标本背景浅黄色，核型深染，端着丝粒染色体的银染蛋白存在的部位呈棕黑色颗粒，选择染色体分散良好，银染颗粒清楚的分裂相，进行计数单侧或双侧有银染颗粒的染色体数。

（2）人体细胞银染颗粒有遗传稳定性，一般正常值为4~8个/核型。

（3）计算方法：NOR   均值=N个核型中含NOR染色体数的和/N个核型

二、间期细胞核活性核仁形成区的银染与观察

1.  收集培养的HL-60细胞和用PHA转化的人正常外周血淋巴细胞分别于离心管中，用1 000 rpm 离心5分钟后弃上清。

2.  用吸管吸打或用指弹法使细胞悬浮，然后用Carnoy固定液固定30分钟。

3.  以1 000 rpm 离心5分钟，弃上清剩约0.5~0.1 ml 液体，使细胞悬浮后滴片。

4.  37℃干燥24小时

5.  银染

6.  镜检

（1）镜下所见，细胞核着色而细胞质不着色，核中活性核仁形成区银染颗粒呈棕黑色，成簇聚集，清晰可分。

（2）肿瘤细胞中与正常细胞中的银染颗粒数量、可见有明显差异。

三、间期细胞核银染活性核仁形成区电镜标本制备与观察

1.  收集培养的HL-60细胞或HeLa细胞于离心管中，随后加入2.5%戊二醛1 ml 预固定10分钟。

2.  以1 000 rpm 离心10分钟，弃上清后加入Carnoy固定液固定5分钟。

3.  接着以2 500 rpm 离心10分钟，弃净上清并用吸水纸吸干残余液体，用耳勺取出细胞团块放于小平皿中。

4.  100%乙醇→双蒸水梯度复水，每步5分钟。

5.  然后将细胞团切成约1 mm3大小的块。

6.  将50%AgNO3（用蒸馏水配制）-2%蛋白胶（用1%甲酸配制）2：1混合液2~3 ml，加入有细胞团块的小平皿中。

7.  移置平皿于56℃水浴中处理20分钟。

8.  彻底水洗3次，每次2~3分钟。

9.  水洗后5%硫代硫酸钠室温处理10分钟。

10.  再水洗3次，转入乙醇一丙酮梯度脱水，每步5分钟。

11.  Epon812包埋。

12.  超簿切片直接地或再经醋酸铀和柠檬酸铅复染后，在电镜下观察。