荧光原位杂交技术检测植物基因组中整合的转基...（三）

3.5 杂交混合变性和杂交

( 1 ) 离心管中准备杂交液，见表14. 1，充分混合。

( 2 ) 在离心管中加入 34 μl 杂交液、2 μl 转基因探针、1 μl 指示探针或对照探针，蒸馏水补齐至 40 μl，作为探针混合液。

( 3 ) 探针变性，放入 70°C 水浴锅 10 min , 然后置冰上 5 min。

( 4 ) 将探针混合液滴到玻片上染色体所在位置，用塑料盖玻片盖好，注意去除所有气泡，如有气泡，需要揭开盖玻片重新盖上。

( 5 ) 将玻片放到加热块上，升温至变性所需温度，一般是 75°C、8 min。根据不同物种、不同制备方法和材料储存时间的不同，变性温度在 70~95℃ 之间，时长 6~12 min ( 见注 14)。

( 6 ) 降温至 37℃ 放置 10~20 min , 将温度保持在 37℃ 准备杂交。

( 7 ) 如果加热板可以保湿，可将玻片保留在加热板上，如果不行，将玻片转移到烘箱的保湿盒或者水浴锅中用于杂交。注意不要让样品干掉，也不要让冷凝水积累到样品上。过夜（16 h ) 。

3.6 严谨性洗涤和杂交位点检测

( 1 ) 配制洗涤液和检测缓冲液，见 2 . 6 节。

( 2 ) 从杂交中取出玻片，检查样品是否蒸干或者被冷凝水打湿。

( 3 ) 在 42℃、2X SSC 中将盖玻片浮去，注意玻片间不要刮擦。

( 4 ) 玻片于 42℃、2X SSC 中洗涤 2 min。

( 5 ) 玻片于 42℃ 严谨性洗涤液中温育两次，每次 5 min , 准确测定并记录洗涤液的温度。使用 0.1% x SSC 高严谨度洗涤或者 2X SSC 低严谨度洗涤（见注8) 。

( 6 ) 玻片于 42°C 的 2x SSC 中洗涤三次。

( 7 ) 从水浴锅中拿出玻片，自然冷却 10~15 min。

( 8 ) 玻片转移至检测缓冲液放置至少 5 min。

( 9 ) 在每个玻片的记号处加入 200 μl 的 BSA , 盖上塑料盖玻片放置 5~30 min。

( 10 ) 根据探针标记准备检测液（见 2. 6节），去掉 BSA , 吸取 50 μl 检测液到玻片上 ，盖上塑料盖玻片，37℃ 保温箱温育 60 min  ( 见注9) 。

( 11 ) 去掉盖玻片，检测缓冲液洗涤三次，每次 5 min。

3.7 复染及封片

大多数样品需要进行 DNA 复染来观察染色体。复染染料颜色必须与探针颜色不同，其信号也不能太亮使杂交信号模糊。因此，建议先染色再封片。一些实验操作将复染和封片合并为一步，这样做省了一个步骤，但是可能导致染色过度和背景值偏高。第一个荧光 FISH 实验使用碘化丙啶染色，当用蓝光或者绿光作为激发光时，染色体呈红色。

双靶标 FISH 实验中，当用红色和绿色标记荧光探针时，使用 DAPI 在紫外激发下呈蓝光比较合适（图 14.3)，因为它常常能同时显示出异染色质带型。在制备染色体过程中， DAPI 也是一种检测染色体的质量和数目的很好染料，当染色体很小时它特别有用 [ 图 14.1  (a ) ] 。

( 1 ) 向载玻片上滴入 50~100 μI 的染色液，用塑料盖玻片盖好，然后于室温、黑暗下放置 10 min  (见注5) 。

( 2 ) 移除盖玻片，用检测缓冲液短暂洗涤（ 见 4 . 2 . 6节）。

( 3 ) 吸干缓冲液，向盖玻片上滴入一滴抗荧光淬灭封片液，然后盖上玻璃盖玻片。配合滤纸片用手挤压玻片以去除多余封片液（ 见注15)。

( 4 ) 玻片观察。淬灭剂可能需要几个小时才能渗透至样品中，因此可放置过夜后再进行观察和拍照。

3.8 观察和拍照

使用落射荧光显微镜观察探针杂交点和染色体染色。本章不是对显微镜的使用进行说明，只是对一些常见问题和解决办法提出如下建议。

( 1 ) 即使使用很好的荧光抗衰剂封片，荧光染料和原位杂交信号也可能非常微弱并会迅速衰减，因此显微镜应置于一个全黑暗房间的固定台面上，并且摆放要便于操作。确保系统合理放置，调整光源居中。

( 2 ) 确保仪器和浸油以及 UV 为荧光专用。浸油应室温黑暗放置。运输车内阳光的热量、混合油、浸油吸水等都会促使浸油自发荧光或者不透 UV。

( 3 ) —般情况下，最好使用针对单一荧光的特定滤波片。多通道滤波片也可以买到，但由于不同荧光的光强不一样导致这种玻片不太好用，并且不同荧光间的杂交激发常使结果很难分析。确保滤波片没有随着使用时间的增加而发生特性改变。

( 4 ) 使用胶片或者数码相机拍照。两者都能获得满足发表标准的图像分辨率。但是，必须注意的是，不管多贵的数码系统都无法补偿显微镜直接观察的优势。当使用胶片时，彩印胶片比幻灯片更好，因为它有更好的曝光范围，并且价格和打印都更便宜。

( 5 ) 玻片应一直放在抗衰减剂中，这样能极大地阻止荧光信号的衰减。

( 6 ) 记录荧光信号前要特别小心，不要让染色体信号尤其是微弱的 FISH 杂交信号衰减。低倍镜下观察一般不会衰减信号。但到 63x 和 100x 时衰减很迅速。有必要先安装好照相系统，焦平面一旦聚焦就可迅速按下曝光键。先将 FISH 信号拍照记录好，在找到满意的 FISH 杂交信号前，不要用 DAPI 观察染色体荧光。

( 7 ) 当观察一个肉眼几乎看不见的弱荧光信号时，聚焦图像会很困难。可以在红光和绿光焦平面之间轮换着观察。DAPI 不便这样操作。

( 8 ) 不论使用数码相机还是普通胶片，使用图像处理软件（ 如 Adobe Photoshop、Corel  Draw 或者其他类似软件包）分析，叠加和组合各种图片是最方便的。但是，必须注意图片不可过度处理。责任人必须清楚地意识到对实验室成员的图像处理是要负责任的！

3.9 转基因的 FISH 分析

实验中最困难的部分可能是判断所观察或记录的信号是否真实可信，尤其是低拷贝转基因的信号。

( 1 ) 检查有丝分裂中期是否完整，染色体形态是否保存完好。染色体可以稍显臃肿，但不能太发散。染色体应该没有破损，没有洞隙或扭曲。

( 2 ) 确保对照探针有预期结果。

( 3 ) 注意观察背景信号和非特异性交叉杂交信号，它们可能模糊掉真正的 FISH 信号 [ 图 I 4.3  (b ) 和 图 14.3  (c ) ] 。任何焦平面外产生清晰边缘的信号都可以去除 [ 见图14.3  (a ) ] 。星点状强信号 [ 图 14.3  ( d ) ] 常常意味着探针或检测剂已经变质。

( 4 ) 统计染色体上的转基因 FISH 信号。分析若干有丝分裂中期细胞，可能的话，鉴定出染色体和 FISH 信号的位置。在一个正常的二倍体细胞中，一个二倍体位点应该在同源基因所在的两条染色质的相同位点上产生荧光信号（ 见注16)。当目的条带小于 50 kb 时，由于染色体的螺旋和挤压，不太可能在同一个分裂中期细胞中观察到所有位点的信号，所以在任意某个分裂中期细胞中，不要指望看到所有的信号点。不过观察 5~10 个或更多分裂中期细胞后，应该能确定哪个是真实信号，哪个是背景信号。当观察到荧光强度高和可靠性好的信号时，表明几个转基因以串联的方式整合到基因组中了[ [18]、[ 19 ] , 见图 14 .3  (a ) ] 。

( 5 ) 最重要的一点是要比较同一个探针或者同一批实验所得到的玻片，以此排除实验失败、实验污染或探针标记无效、抗体稀释度不合适或者其他试剂使用不当等因素。