microRNA的实时定量茎环RT-PCR技术
microRNA的实时定量茎环RT-PCR技术
摘要：
已开发出一种新型的microRNA（miRNA）的定量方法，即利用茎环反转录，Taqman PCR分析。茎环RT引物在RT 效率和特异性方面比传统的更好。TaqMan miRNA的检测是很具体的，可以检测成熟miRNA和区分相关的甚至低至一个核苷酸的miRNAs。此外，他们不会受到基因组DNA污染的影响。精确量化可以从低至25皮克的总RNA中提取大多数miRNA。
事实上，这种方法灵敏度高，特异性强和精密度高，允许无需核酸纯化，直接分析单个细胞。
如标准TaqMan基因表达分析，TaqMan miRNA的检测显示出了7个数量级的动态范围。七个小鼠组织中五个miRNA定量显示，在每个细胞中，有低至10到超过30000个拷贝数。这种方法可以确保快速，准确，灵敏miRNA表达谱，并能识别和监控特定组织或疾病的潜在生物标志物。茎环RT-PCR可用于其他小RNA分子，如短干扰RNA（siRNAs）的量化。此外，为更好的特异性和效率，茎环RT引物设计的概念可以应用在小分子RNA克隆和多重检测。
引言：
miRNA是自然发生的，高度保守的转录家庭，来源于较大的发夹前体。miRNA是在动物和植物的基因组上发现的。到目前为止，有1000个独特的转录产物，其中，在桑格中心miRNA的注册表中包括326人类miRNA。
miRNA是通过催化mRNA的分裂或抑制mRNA的翻译来调节基因表达。他们被认为在细胞发育，分化和传导中发挥着重要作用。具体职责包括调节细胞增殖和新陈代谢，发育时间，细胞死亡，造血，神经发育，人类肿瘤形成与DNA甲基化和染色质修饰。
虽然miRNA的相对丰富的转录产物类别，其表达水平在物种和组织之间相差很大。低丰度的miRNA经常逃避检测技术，如克隆，Northern杂交和基因芯片分析。这里，我们提出一种新型实时定量方法，能够准确灵敏地检测miRNA与其他小分子RNA。这种方法扩展了实时PCR技术，从大分子的基因表达到微分子的变化检测。
材料和方法
从桑格中心的miRNA注册网站 http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml 中筛选目标，引物和探针。所有TaqMan miRNA检测，可通过应用生物系统公司（P / N4365409）得到。miRNA标准TaqMan分析，采用PrimerExpress软件设计PRI-LET-7A-3和PRI-MIR-26B和miRNA前体miR-30A。所有序列在补充资料部分可用。合成miRNA的寡核苷酸从Integrated DNA Technolo-gies (IDT, Coralville, IA)购买。
RNA样本组织，细胞，细胞裂解物和总RNA制备
从Ambion公司（P / N7810，7812，7814，7816，7818，7824，7826和7968）购买10-12天老鼠的脑，心，肝，肺，胸腺，卵巢和胚胎的总RNA样品。 Ambion公司鼠的总RNA来自瑞士韦伯斯特小鼠。基于TaqMan基因表达分析人类或小鼠的3 -磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）内对照（P / N4310884E4352339E，应用生物系统公司）所有的RNA样品进行标准化。
两个细胞株HepG2和OP9，培养，使用Gibco公司MEM（P / N 12492-021，Invitrogen，Carlsbad, CA）补充10％胎牛血清（FBS）(P/N: SH30070.01, HyClone, Logan, UT)培养。用血球计对胰酶消化细胞计数。约2.8×106个悬浮细胞通过离心沉淀，1500r.p.m.离心5分钟，用1毫升不添加 MgCl2 and CaCl2的杜尔贝科的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。
细胞再悬浮于140毫升PBS，并用三种不同的样品制备方法处理。第一种方法，一个50毫升的样本（106个细胞）等量的核酸纯化裂解液混合，用吸管反复吹打十次，然后旋转。在添加到RT反应体系前，将裂解液用1 U / ml的RNase抑制剂溶液稀释1/10。在第二种方法中，用mirVanamiRNA提取试剂盒提取50毫升的样本（106个细胞）。纯化的总RNA在100毫升洗脱缓冲液中洗脱。第三种方法用1×PBS稀释1/2，95℃加热5分钟，在加入RT反应体系前立即在冰上保存。
用mirVana miRNA检测试剂盒检测miRNA
根据制造商的协议，使用mirVana-miRNA的检测试剂盒对miRNA杂交分析。由IDT合成RNA探针。放射性同位素标记的RNA片段用气旋存储荧光粉系统进行检测和定量。
反转录酶反应
逆转录反应中包含的RNA样品，包括纯化总RNA，细胞裂解物，和热处理细胞，50纳米的茎环RT引物，1×RT缓冲液，每dNTPs浓度0.25毫米，3.33 U / µL 的逆转录酶和0.25 U / µL的RNase抑制剂。7.5微升反应体系在9700温度循环器96 -或 384-平板上16℃培养30分钟，42℃30分钟，85℃5分钟，然后保持4℃。所有逆转录反应，包括无模板对照和RT负对照，都进行一次重复。
PCR
采用标准的TaqManPCR试剂盒进行实时PCR。 10μLPCR反应体系包括0.67μLRT产物，1×TaqMan Mix ，0.2μM的TaqMan探针，1.5m M正向引物和0.7µM反向引物。反应在 384-平台上95℃培养10分钟，95℃15秒60℃1分钟40个循环。所有的反应一式三份。 C T为在荧光通过固定阈值的循环数。荧光定量CT值转换成绝对数量的拷贝数，使用合成林-4 miRNA的标准曲线。
结果
我们提出了一个新的miRNA的定量的实时RT-PCR技术方案。它包括两个步骤：RT和实时PCR。首先，茎环RT引物是与miRNA分子杂交，然后用Multi-Scribe反转录。接下来，用传统的TaqMan PCR，对RT产品进行定量。
图1。上图描述的是TaqMan miRNA的检测原理，基于TaqMan实时定量miRNA的包括两个步骤，茎环RT和实时PCR。茎环RT引物结合在miRNA分子的3'端和用反转录酶逆转录。然后，RT产品使用传统的TaqMan PCR定量，其中包括特定miRNA的正向引物，反向引物和染料标记的TaqMan探针。尾正向引物5'的作用是根据miRNA分子的序列组成增加其熔融温度（Tm）。
图2。TaqMan-4 miRNA的检测的动态范围和灵敏度。 （A）4超过7个数量级的 lin-4 miRNA扩增曲线。合成的RNA输入范围从1.3×10－3 fM（相当于每次反应7个拷贝数） 〜1.3×104 FM（相当于每次反应7×107拷贝数）；（B）lin-4 miRNA的标准曲线。
miRNA定量的动态范围和灵敏度的计划使用一种人工合成的CEL-LIN-4靶进行首次评估。合成的RNA在 A26值的基础上量化，稀释超过7个数量级。 CEL-LIN-4 TaqMan miRNA的检测结果显示在目标输入和CT值之间有极好的线性关系，表明，该检测有至少7个动态范围，并能够检测PCR反应中少于7个的拷贝数（图2）。
采用小鼠肺总RNA的八个额外miRNA的检测也被证实。RNA的输入范围从0.025到250纳克（图3）。 相关的RNA输入的TheCT 值超过4个数量级（R2>0.994）。阴性对照检测中，即使在250纳克总RNA鼠标的反应中，CEL-MIR-2没有给出一个检测信号。
根据七个不同的鼠组织中五个miRNA的表达谱测定，创建一个miRNA的表达图谱。每个细胞中的拷贝数根据输入的总RNA（假设15皮克/细胞）和合成lin-4目标的标准曲线计算。从这个表达图谱上作了一些有趣的观察。首先，miRNA非常丰富，组织中每个细胞平均有2390个拷贝数。每个细胞表达的拷贝数在10-32090之间变化。在所有组织中，12个miRNA里，miR-16和miR-323是最丰富和最低量表达的miRNA。此外，每个组织都有独特的miRNA的表达水平。miRNA表达的整体水平在小鼠肺中最高和胚胎中最低。最后，在7个组织中，miRNA表达的动态范围变化很大，从不到5倍(let-7a)到超过2000倍(miR-323) （表1）。
评估RNA分离的需要，我们直接在miRNA的检测中增加了细胞裂解物。相当于直接在7.5毫升逆转录反应中添加2.5-2500细胞。当检测到，在一些细胞中CT值相关R2>0.998）的RT反应至少有三个数量级（图4）。
图3。总RNA输入的阈值循环（CT）值检测8个miRNA的相关性。每RT反应中，小鼠肺总RNA输入范围从0.025到250纳克。将新杆状线虫的miRNA（MIR-2）列入作为阴性对照。
鼠或人的脑，心，肝，肺，胸腺，卵巢和胚胎（10-12天）的总RNA样品均购自Ambion公司。根据标准曲线lin-4合成的miRNA对每个细胞拷贝数进行估计。每个RT反应中添加150ng的RNA（或相当于约10 000个细胞，假设每个细胞中有15pg总RNA）。依据TaqMan磷酸甘油醛脱氢酶的内对照（P / N4352339E）将RNA规范化输入。
检测了12组非特定的基因组DNA对TaqMan miRNA的影响。结果表明，RT反应中是否添加5纳克人类基因组DNA对CT值没有影响，表明RNA的目标（数据未显示）检测是非常特异的。基于这一观察，我们直接miRNA定量检测中增加了热处理细胞。图5显示了使用纯化总RNA，细胞裂解物，从同样数目的HepG2细胞得到的热处理细胞的miRNA进行定量比较。直接添加热处理细胞的miRNA的检测CT值最低，和其他三种不同的样品制备方法相似。
图4。使用OP9细胞裂解物检测TaqMan miRNA的动态范围。 每个RT体系中输入细胞数范围为3至2500个细胞。采用新杆状线虫elegans miRNA（MIR-2）作为阴性对照。
图5。对热处理细胞，细胞裂解液和10 miRNA实时定量总RNA进行比较。用阈值循环（CT）来衡量miRNA的表达水平。每PCR扩增约400 HepG2细胞进行了分析。
图6。的TaqMan miRNAmiR-16的分析比较来解决以印迹杂交为基础的分析。总RNA来自小鼠肾，肝，肺，脾和睾丸组织。
由两个独立运行系统（数据未显示）对12 miRNA16重复检测TaqMan miRNA的可再现性。CT的标准偏差平均为0.1，显示检测的高精度。
我们采用一个独立的技术，这个技术是基于杂交印迹的miRNA分析，比较TaqMan miRNA的检测（图6）。我们观察到杂交为基础的miRNA分析重复性差，在从目标到目标的变化中和TaqMan分析一致。五个鼠组织样本中的miR-16的两种方法（R2= 0.916）一致。然而，在低丰度的miRNA中相关性相对较低，如miR-30的（R2= 0.751）。
杂交的方法对成熟的miRNA来讲缺乏特异性。我们调查了TaqMan miRNA区分成熟miRNA和较长的前体的检测能力，合成pri-miRNA前体，pri-miR-26b和pri-let-7a和pre-miRNA 前体pre-miR-30a（见表2）。 TaqMan分析旨在检测前体和成熟的miRNA进行合成平均1.5的目标×108％RT反应副本（每PCR体系1.3×107拷贝数）。仅PRI-miRNA前体分子的TaqMan miRNA的分析产生了较成熟的miRNA的分析高出至少11个循环的CT值。这一结果意味着，如果成熟的miRNA和前体在浓度相同，后者将在检测成熟的目标时贡献<0.05％的背景信号。对于pre-miR-30a来讲，成熟的miRNA miR-30a-3p定位于在pre-miR-30a序列3’末端，观察到8.4 CT的差异。结果表明，对于成熟miRNA来说，TaqMan miRNA的检测是特异的。然而，如果miRNA位于pre-miRNA前体链5'端，特异性分析更好。总RNA实验分析代替合成目标，表明，前体与成熟miRNA相比，至少丰富度小于两个数量级，基于CT 在miR-26b-1 和 let-7a-2前体的差异多于7个或7个以上数量级。一并考虑，这些结果表明，对于成熟miRNA来说，TaqMan miRNA的检测更加特异。
图7。let-7 miRNA的检测鉴别力。相对检测（％）计算是基于CT完全匹配和不匹配的目标之间的差异。在RT反应中添加合成RNA的1.5×108 拷贝数。估计浓度在A260 值的基础上。
TaqMan miRNA的检测能力不同，是依据采用let-7a, let-7b, let-7c, let-7d 和let-7e 5个合成miRNA来检测低至一个核苷酸（图7）。每个miRNA的检测对应每个miRNA。相对探测效率是通过计完全匹配和不匹配的目标CT之间的差异，假设完美匹配的效率为100％。观察非特异性信号处在非常低的水平，从零到0.3％，对于miRNA有2-3不匹配，0.1-3.7％的单核苷酸不同。许多交叉反应，是由RT反应反应中G-T的错配导致的。如果miRNA之间出现超过三个不匹配，会有针对性的miRNA检测。
我们比较歧视的TaqMan miRNA的检测能力的不同，以解决杂交分析为基础的检测（图8）。在我们的手中，杂交方法可以很好地区分let-7a和let-7b。然而，在let-7a, let-7c 和 let-7d之间，几乎没有区别，而是由1–3 nt区分。
我们推测，茎环引物可能会比线性引物提供更好的RT效率和特异性。依据茎环的堆放可能加强RNA-DNA的热稳定性。此外，与传统的线性RT引物，茎环的空间约束可能会提高检测的特异性。我们比较的茎环和线性RT引物合成miRNA let-7a的灵敏度和特异性(图 9)。我们观察到了茎环RT几个优势。首先，在合成let-7A目标时，线性和茎环RT方法CT值有7个数量级不同，表明茎环RT的效率高出至少100倍。其次，茎环RT在区分miRNA之间不同时，是基于ΔCT值两个原则的不同。最后，依据7个数量级ΔCT，对于区分成熟的miRNA和其前体，茎环RT至少好100倍。
讨论
由于miRNA的发现，这些基因家族的特征的显著进展已经描绘了基因调控中miRNA功能的机制。因此，识别miRNA的生物标记特定的组织类型或疾病状态的广泛的研究已经开始。这些研究将会受益于miRNA准确识别和量化方法。
当前检测和量化miR-NAs的方法主要基于克隆，Northern杂交，或引物延伸。尽管芯片可以提高miRNA谱的产量，该方法在灵敏度和特异性方面有着是相对的局限性。对于miRNA的定量，灵敏度低已成为一个的问题，因为很难放大这些短的RNA目标片段。此外，特异性低，可能会导致密切相关的miRNA、前体和基因组序列的错误的积极信号。最近，已报道了针对miRNA量化的修改后的侵袭物检测。然而，侵袭物检测特异性和敏感性有限，每检测至少需要50 ng总RNA，或1000裂解细胞。
实时PCR是基因表达的定量的金标准。对于科学家来说，设计常规PCR，检测平均22个核苷酸长度的miRNA，一直是一种长期挑战来。我们开发了一种新的机制来设计TaqManPCR反应检测，用超过现有的常规检测方法的优越的性能来特异量化miRNA的表达水平。我们设计和验证检测了222个人的miRNA。这些分析相结合了PCR技术精湛的灵敏度，实时监控动态范围和TaqMan方法报道，以增加特异性。在我们的手中，与成熟miRNA相比，miRNA前体的效果至少差2000倍。由于对于前体或基因组DNA这些检测是不敏感的，我们可以直接添加热处理细胞检测，消除了样品制备的需要。对于成熟的miRNA及其前体的检测的需要，可用传统的TaqMan分析法来特异地检测前体。
我们观察到由于碱基堆积和空间约束的茎环结构，茎环RT引物比传统的线性引物有更好的特异性和敏感性（图9）。碱基堆积性可以提高热稳定性，并延长有效的RT引物/ RNA双螺旋，可能需要相对较短的逆转录引物来提高RT的有效性。茎环结构的空间限制，可以防止结合基因组双链DNA。因此，RNA样品制备为消除TaqMan miRNA的需要。潜在的茎环RT引物可以为多重RT反应和小分子RNA克隆可能提供更好的效率和特异性。
对于整体miRNA谱有一个敏感的、特异地增加需求。有效高调的miRNA的能力可能会导致miRNA的生物标志物疾病或组织特异性的发现，以及有助于理解miRNA如何调节干细胞分化。我们的茎环RT-PCR方法，可以为这些研究提供了一个切实可行的解决办法。我们目前正在开发多重办法，要进一步提高这种方法的效用。
来源：BioTNT（冠泰生物）
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标签： microRNA 实时定量 茎环 RT-PCR
