scale-X生物反应器系统在慢病毒和腺病毒载体生产中...-1
我们之前在Pall
iCELLis®固定床生物反应器中，以小规模和商品化规模，进行了病毒载体（慢病毒、腺病毒以及腺相关病毒）的生产。最近，一家名为Univercells的比利时公司推出了一种新型固定床生物反应器，其具有相同的细胞生长表面基质材料，但固定床结构与iCELLis生物反应器所使用的结构不同。我们尝试对这种新型scale-X
hydro生物反应器（2.4m2）和iCELLis
Nano系统（2.67m2）进行一对一比较，以了解这种差别对细胞生长及慢病毒载体或腺病毒载体产量的影响。实验运行使用在iCELLisNano生物反应器中针对病毒载体生产而优化的参数进行。细胞生长通过细胞核计数以及跟踪葡萄糖消耗和乳酸产生来监测。在两种生物反应器系统中，细胞生长良好，且发现scale-X生物反应器中细胞分布相当均匀。结果证实，在慢病毒载体和腺病毒载体生产中，Univercells的scale-X生物反应器至少可获得同等效率，甚至更优化。基于这些结果，用于iCELLis生物反应器中病毒载体生产的相同程序和参数也可成功用于scale-X生物反应器系统中的生产。
简介
用于基因治疗的病毒载体仍主要以贴壁细胞生产。标准的小规模生产依赖于不同的培养瓶方法，而规模放大选择有，例如Cell
Factories（细胞工厂，ThermoFisher
Scientific）或Hyperstacks（Corning）。但是，这些方法需要大量的人工操作，可能需要开放式连接，且不能监测或控制pH、溶氧等。所以，需要用于贴壁细胞的大规模、可抛弃型生物反应器。ATMI/Pall在十多年前推出了iCELLis固定床生物反应器。iCELLis
Nano生物反应器的三维固定床由数百根13.9
cm2的小尺寸聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）纤维（“载体”）组成，其装填在生物反应器内。iCELLis生物反应器提供高（144g/L）和低（96g/L）两种压缩结构。iCELLis
Nano生物反应器的培养面积可达4.2m2，对于小规模批次来说，是非常有用的工具，但其主要用于工艺开发和优化。iCELLis
500是商品化规模系统，根据固定床高度和载体压缩程度，其培养面积范围为66 –
500m2。我们是最早将iCELLis技术用于基于HEK293(T)贴壁系统，以进行腺病毒、慢病毒和腺相关病毒（AAV）载体生产工艺的团队之一。工艺开发在iCELLis
Nano生物反应器上进行，然后工艺规模放大至iCELLis 500规模，目前，我们已在iCELLis
500中生产了用于临床试验的病毒载体物料。我们每个批次可生产>1x10^16腺病毒颗粒。其它团队也发现iCELLis生物反应器可有效用于逆转录病毒、AAV、狂犬、甲肝以及基孔肯雅疫苗的生产，或以昆虫细胞生产重组蛋白。iCELLis
500生物反应器是一种符合GMP要求、完全可抛弃且可控的系统，并具有灌流能力。系统支持贴壁细胞生长和高滴度生产。
基于对iCELLis系统的专业知识，我们自然对Univercells新近推出的贴壁生物反应器深感兴趣。Univercells的scale-X生物反应器系统是一种自动化及一次性使用固定床生物反应器，其培养面积范围为2.4m2（商品名为hydro）至600m2（nitro）及以上。Univercells附有10-30m2“中型尺寸”scale-X
carbo生物反应器系统。到2020年，所有的scale-X生物反应器可用于GMP生产。系统适合，例如，体外使用，特别是当产量要求低于直接将病毒载体注入患者体内所需要求时。系统的固定床材料与iCELLis固定床相同，但是结构不同。iCELLis固定床使用微载体相对随机的填充，而在scale-X生物反应器中，固定床是5cm2宽度的刚性聚丙烯筛网条带和非编织亲水性聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）织物交替螺旋管式组成的双层的均一结构，层间由间隔网隔开。这种结构可在整个固定床中实现更好、更均匀的细胞分布。除了病毒载体生产外，scale-X生物反应器系统也可实现连续的在线浓度，因为系统可选择内置中空纤维切向流过滤模块。通过将scale-X生物反应器与NevoLine微型工厂结合，使用用于生物反应器和在线下游处理的链式封闭柜体，可降低GMP设施要求。我们测试将这种新型scale-X
hydro生物反应器系统用于慢病毒和腺病毒载体生产，以确定不同的膜基质装置是否会影响细胞生长或病毒载体产量，并将系统与iCELLis生物反应器进行了比较。两种生物反应器系统使用此前在iCELLis生物反应器上优化的相同参数。结果发现，在两种生物反应器中，细胞生长相似。Scale-X
hydro生物反应器中的产量至少与iCELLis Nano系统中的产量相当。
材料和方法
细胞系和培养基
293T（ATCC，Manassas，VA）和HEK293（ATCC）细胞培养在添加了10%（v/v）胎牛血清（FBS，Gibco）以及50-100
U/mL青霉素、50-100μg/mL链霉素（Gibco）和4mML-谷氨酰胺（Gibco）的高-或低-葡萄糖DMEM培养基（Gibco，Paisley，United
Kingdom/Sigma-Aldrich，Irvine，United
Kingdom）中进行，用于慢病毒载体和腺病毒载体生产。此外，在慢病毒载体生产中，转染后（PT）培养基补充1x非基本氨基酸（Gibco）、1mM
丙酮酸钠（Gibco）以及1:500
CD-脂质添加物（Gibco）。FBS包含在生物反应器接种前、细胞扩增时的起始培养基中以及直到转染后24h的生物反应器运行中，之后的运行不添加FBS。接种密度7,000
– 9,000 cells/cm2。接种前，所有细胞培养在+37℃、5%CO2湿化环境的T型瓶中。
用于慢病毒载体感染性滴度分析的HeLa细胞（ATCC）培养在DMEM-10%FBS（Gibco）-50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素（Gibco）中。转导时不含FBS。
iCELLis Nano和scale-Xhydro生物反应器中的慢病毒载体生产
总共进行4个scale-X生物反应器运行。在3个运行中，生产慢病毒载体，另1个运行中，在转染前，按Univercells提供的指导，对生物反应器进行拆解，以分析固定床不同区域的细胞密度。一个iCELLis Nano生物反应器作为对照，平行运行。
iCELLis Nano中的慢病毒载体生产使用2.67m2低压缩固定床生物反应器（Pall Life
Sciences，Hoegaarden，Belgium）。在scale-X生物反应器运行中，使用Univercells（Gosselies，Belgium）的2.4m2
scale-X
hydro生物反应器。运行按此前描述进行，使用灌流维持目标0.5g/L葡萄糖。葡萄糖和乳酸每天检测1次或2次（Cedex-Bio，Roche，Mannheim，Germany）。接种后的1h，生物反应器培养基取样，对非贴壁的细胞进行计数。按此前报导，在第1-4天，对iCELLis
Nano生物反应器中贴附到载体的细胞进行细胞核计数。在scale-X hydro生物反应器中，膜层间有采样条（与iCELLis
Nano生物反应器中的载体尺寸大致相同），可与iCELLis
Nano系统相似地进行取样和细胞核计数。对于每个细胞核计数，使用无菌镊子取两根采样条。此外，1个scale-X生物反应器固定床拆解，对固定床顶部（距离顶部边缘1cm）、中部和底物（距离底部边缘1cm）、两个膜层以及固定床的外、中和内表面进行细胞核计数（图1）。对于细胞核计数，从膜上裁1cm2小片。
在所有运行中，以1:1的DNA：PEIpro比例和200 ng/cm2质粒（PlasmidFactory Bielefeld，Germany），使用PEIpro（Polyplus-transfection，Illkirch，France）–介导转染，生产三代LV-GFP。转染按此前描述进行。
开始收获前，进行完整的培养基置换，转染后24– 72h，在室温条件下，通过收集灌流培养基，收获病毒载体。运行结束时，生物反应器排放至相应的收集袋中。
iCELLis Nano和scale-Xhydro生物反应器中的腺病毒载体生产
总共进行了两个生物反应器运行，一个使用scale-X生物反应器，一个使用iCELLis
Nano系统，以比较腺病毒载体生产的差异。除与慢病毒运行一样，通过灌流控制目标0.5g/L葡萄糖外，运行按此前描述进行。细胞接种密度为7,000
cells/cm2,。与慢病毒运行相似地，葡萄糖和乳酸每天检测2次（Cedex-Bio），第1-4天进行细胞核计数。感染按之前描述进行，两个生物反应器使用相同的腺病毒载体（Ad-GFP）数量（平均感染复数值为75）。感染后68h，使用基于去垢剂的裂解方法进行细胞裂解。收获物料使用0.027
m2深层滤器（Millipore，Billerica，MA）澄清。
图1. 拆解的Univercells scale-X hydro生物反应器的细胞技术。从顶部（a）和侧面（b）观察的scale-X 生物反应器示意图。淡灰和深灰点指示用于细胞密度分析的取样点。淡灰=内侧膜的取样，深灰=外侧膜层的取样。对于细胞密度分析，对固定床顶部、中部和底物、卷膜的外表面、中部以及内表面进行细胞核计数。示意图下方表格中所示为细胞密度（cells/cm2）。
分析
慢病毒载体的感染性滴度（转导单位[TU]/mL）使用基于定量聚合酶链式反应（qPCR）的方法确定。慢病毒载体颗粒（vp）滴度通过将p24酶联免疫吸附分析（ELISA；PerkinElmer，Waltham，MA）的pg/mL结果转换为vp/mL来分析，假定p24的1pg为12,500慢病毒颗粒。腺病毒载体颗粒滴度使用高效液相色谱（HPLC）分析。
结果和讨论
ATMI/Pall大约在10年前推出了第一款全整合式、可抛弃型固定床生物反应器iCELLis。此外，市面上也有一些其它公司开发的贴壁生物反应器，如Celligen（NewBrunswick
Scientific）、CellCube（Costar）、装填床生物反应器（BioBLU，Eppendorf）以及基于微载体的生物反应器。在最近的创新产品中，还包括Univercells生产的scale-X生物反应器，该公司由JoseCastillo联合创立，他也是iCELLis系统的发明者之一。我们的团队对于使用iCELLis生物反应器进行病毒载体生产具有丰富的经验。由于iCELLis和scale-X生物反应器中，用于细胞贴附的膜采用相同的材质，我们假设在iCELLis生物反应器中优化和使用的参数可相当简单地转移到scale-X生物反应器。为测试这种假设，我们比较了scale-X生物反应器和iCELLis
Nano系统中的细胞生长、细胞分布、培养基消耗以及慢病毒和腺病毒载体生产。
细胞分布
我们之前比较了iCELLis
Nano生物反应器高压缩固定床（4m2）和低压缩固定床（2.67m2）中的细胞分布，发现在低压缩中，细胞分布更加均衡。在高压缩固定床中，细胞分布有较大的差异，取决于计数的细胞来自哪一层（相比顶部，底部的细胞量要高3到4倍）。尽管在低压缩固定床中，差异性较小，我们还是注意到，相比底部，低压缩床中部的细胞量要高2到3倍。对拆卸的scale-X生物反应器进行了细胞密度分析，以了解固定床不同部分中的细胞分布（图1）。结果发现，在整个固定床中，细胞分布相比均衡（图1）。但是，当垂直或水平分析时，固定床中部的细胞密度要高约2倍，这与低压缩iCELLis生物反应器中的结果较为接近。当对双层膜的外膜和内膜进行细胞密度分析时，发现差异很小。这可能是由于scale-X生物反应器固定床的卷式膜样结构形成了批次间细胞密度以及细胞生长更低的变异性。相比scale-X生物反应器，iCELLis生物反应器中，特别是在高压缩固定床中，细胞密度更高的变异性，可能是由于载体相对随机且紧实的填充。所以，在iCELLis生物反应器中，由于存在一些低致密和高致密区域，每个反应器之间总是有差异。
此外，在拆解前，对拆解的生物反应器的采样条进行取样，计算密度为~1.1x10^5cells/cm2，接近膜顶-中部的密度（1.2x10^5±0.4x10^4）。所以，可见scale-X生物反应器中的采样条具有代表性，可用于评估细胞密度。
