无菌感染期线虫的诱导培养
实验概要
掌握无菌 S. carpocapsae A24品系感染期线虫的诱导培养。
主要试剂
1. 琼脂糖（Agarose），进口分装，上海Yito公司；
2. 胰蛋白胨（bacto-tryptone）、酵母浸出粉（bacto-yeast extract），英国OXOID公司；
3. 琼脂粉，广东环凯微生物科技公司；
4. DEPC，Bio Basic inc公司；
5. LB培养基
Tryptone 10 g
Yeast Extract 5 g
NaCl 10 g
pH 7.2
加水至1000 mL（固体培养基加1.8％琼脂粉）；
6. 80％甘油：称取100.8 g甘油（密度为1.26 g/cc）于20 mL 双蒸水中，高压灭菌15 min，室温保存。
主要设备
1. MDF-192型超低温冰箱，日本三洋电机株式会社；
2. CF43S超净工作台，Gelman公司；
3. 高速冷冻台式离心机，Heraeus Sepatech公司；
4. THZ-C恒温振荡器，广州市深华生物技术公司；
5. BL150S型电子天平，德国Sartorius公司；
6. GB 1302型天平，Mettler-Toledo仪器（上海）有限公司；
7. C-90-1型电热恒温水浴锅，广州市越秀区医疗器械厂；
8. 微波炉，日本Sharp；
9. YXQ.WY21-600IIR卧式高压蒸汽消毒器，广州市医疗设备厂；
10. XSZ-D2型倒置显微镜，重庆光学仪器厂。
实验材料
1. 小卷蛾斯氏线虫 S. carpocapsae A24品系；
2. 共生细菌X. poinarii RS92品系。
实验步骤
1. 单菌线虫S. carpocapsaeA24的培养
参照Han et al.（1990）[1]和韩日畴（1995）[2]建立的方法，将无菌S. carpocapsae的A24品系与X. poinarii的RS92 共生细菌菌株建立单菌组合（RS A）并用人工培养基进行体外培养[3,4]。人工培养基成分为1％蛋白胨，1％牛肉浸膏，20%鸡蛋，15％豆粉，5%猪油，8%聚乙醚氨基甲酸酯海绵和50%无离子水[93]。培养温度25℃。
2. 无菌感染期线虫S. carpocapsae A24的获得
上述线虫培养30天后，进行体表消毒，即可获得无菌感染期线虫。具体方法如下：
1) 将培养好的RS A组合的线虫培养基倒入已消毒的带滤布及筛网的不锈钢盆内，加无菌水室温浸泡约3 h，浸泡时以不锈钢盆盖住，以防止飞虫的污染。大部分感染期线虫将从海绵培养基中爬出，穿过滤布沉淀于容器底部；
2) 移去滤布、筛网和网内的海绵及培养基等杂质，静沉后，倾去上层液, 加入无菌水清洗线虫6～7次，每次约15 min；
3) 将线虫液转入三角瓶中，以0.5%硫酸链霉素室温，100 rpm，振荡消毒6h，以保证抗菌素充分接触线虫；
4) 用无菌水清洗线虫6～7次，再用无菌乐百氏水清洗线虫至少2次，每次约15 min；
5) 最后得到无菌的感染期线虫悬液100 mL～200 mL，稀释到一定浓度，分装若干瓶；
6) 取样计数，计算出每毫升悬液中的线虫含量，于4℃摇床中保存；
7) 取200 μL线虫悬液滴入100 mL LB培养基中，100 rpm振荡，检测带菌情况。取少量线虫液滴到LB平板上，检测带菌情况。
3. 无菌感染期线虫A24的诱导
1) 取-80℃共生细菌 X. nematophila A24 甘油储存菌20 μL于200 mL在LB平板上划线，25℃，培养48 h；
2) 从LB平板上挑取单菌落接种至4 mL LB液体培养基中，25℃，200 rpm，振荡培养36 h。将活化菌按3％接种量转接至200 mL培养基中，振荡培养36 h；
3) 将菌培养液置于15 mL无菌的离心管中，4℃下，6000 rpm 离心15 min；
4) 取上清，细菌过滤器除菌到无菌烧杯中，混匀；
5) 于6＃细胞培养板中，分别加入3 mL菌过滤液，再加入100 μL无菌感染期线虫，25℃约100 rpm下诱导恢复10 h；
6) 同样的操作，用Ringer’s 溶液作对照；
7) 将处理的线虫吸到经DEPC水处理过的无菌离心管中，离心（25℃，2000 rpm，1 min），吸弃上清；
8) 加适量的0.2%DEPC水清洗线虫，离心（25℃，2000 rpm，1 min），重复清洗4次；
9) 将清洗最后一次的线虫转入已称量的无菌离心管内，再称量算得线虫的体积，将离心管放入烧杯，加液氮，-80℃贮存。
参考文献：
1. Han R C, Wouts W M, Li L Y. Development of Heterorhabditis spp. strains as characteristic of possible Xenorhabdus luminescens subspecies[J]. Rev. Nematol. 1990, 13: 411~415.
2. 韩日畴. 昆虫病原线虫大量培养系统的优化管理（D）. 华南农业大学博士研究生毕业论文，1995.
3. Bedding R A. Low cost in vitro mass production of Neoaplectana and Heterorhabditis species （Nematoda） for field control of insect pests[J]. Nematologica.1981, 27: 109~144.
4. Wouts W M. Mass production of entomogenous nematode Heterorhabditis heliothidis（Nematoda：Heterorhabditidae） on artificial media[J]. Journal of Nematology.1981, 13: 467~469.
