急性中毒物质的快速筛选和检测（二）

　　方法一速测卡法(纸片法)

　　2.1范围

　　本标准规定了由酶抑制法测定蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检验方法。本标准适用于蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速筛选测定。

　　2.2原理

　　胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯(红色)水解为乙酸与靛酚(蓝色)，有机磷或氨基甲酸脂类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。

　　2.3试剂

　　2.3.1固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片(速测卡)。

　　2.3.2 pH7.5缓冲溶液：分别取15.0g磷酸氢二钠[Na2HPO4·12H2O]与1.59g无水磷酸二氢钾[KH2 PO4 ]，用500mL蒸馏水溶解。

　　2.4仪器

　　2.4.1常量天平

　　2.4.2有条件时配备专为速测卡而设计的“农药残留速测仪”和超声波提取器。

　　2.5分析步骤

　　2.5.1表面测定法(粗筛法)：擦去蔬菜表面泥土，滴2～3滴浸提液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上。放置10分钟进行预反应，将速测卡对折(红色药片与白色药片叠合)后，用手捏3分钟时，打开与空白对照实验卡比较，白色药片不变色或略有浅蓝色均为阳性结果。白色药片变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性结果。有条件时，将纸片插入“农药残留速测仪”自动恒温、定时检测。

　　2.5.2整体测定法：选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取5g放入带盖瓶中，加入10mL浸提液(样品与浸提液的比例为1﹕2)，震摇50次(有条件时，可将提取瓶放入超声波提取器中震荡30秒)，静置2分钟以上。取一片速测卡，在白色药片上滴上2～3滴提取液，放置10min进行预反应，以下操作和观察结果与5.1法相同。有条件时，将纸片插入“农药残留速测仪”自动恒温、定时观察。

　　2.6干扰物质与排除方法：目前国内外所使用的农药残留测定方法(纸片法和分光光度法)的检验原理基本相同，测定中的干扰物质也基本相同。葱、蒜、萝卜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，不要剪的太碎。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也不要剪的太碎。

　　2.7使用注意事项：当温度条件低于37°C，酶反应的速度随之放慢，速测卡加液后放置反应的时间应相对延长，延长时间的确定，应以空白对照卡用(体温)手指捏3分钟时可以变蓝，即可往下操作。样品放置的时间应与空白对照卡放置的时间一致才有可比性。红色药片与白色药片叠合反应的时间以3分钟为准，3分钟后的蓝色会逐渐加深，24小时后颜色会逐渐退去。空白对照卡不变色的原因，一是药片表面浸提液加的少、预反应后的药片表面不够湿润，二是温度太低。

　　2.8速测卡法的检出限与符合率：表1是由卫生部食品卫生监督检验所、广东省食品卫生监督检验所、北京市产品质量监督检验所、香港政府化验所、广东省农药检定所、深圳市卫生防疫站、华南农大昆虫毒理研究室七个单位，使用速测卡法，对我国常见使用的一些有机磷和氨基甲酸酯类农药检出限的实验与验证数据的统计表

　　表1常见农药的检出限与国家允许蔬菜中最大残留限量(mg/kg)

　　在使用速测卡法检出蔬菜样品为农药阳性时，即可视为有机磷或氨基甲酸酯类的农药已超标。有条件时，可用气相色谱仪或质谱仪对阳性试样进行进一步的实验来确定是哪种农药、确切含量。

　　方法二酶抑制率法(分光光度法)

　　2.9原理

　　在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物(乙酰胆碱)水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。

　　2.10试剂

　　2.10.1 pH8.0缓冲溶液：分别取11.9g无水磷酸氢二钾与3.2g磷酸二氢钾，用1000mL蒸馏水溶解。

　　2.10.2显色剂：分别取160mg二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和15.6mg碳酸氢钠，用20mL缓冲溶液溶解，4°C冰箱中保存。

　　2.10.3底物：取25.0mg硫代乙酰胆碱，加3.0mL蒸馏水溶解，摇匀后置4℃冰箱中保存备用。保存期不超过两周。

　　2.10.4乙酰胆碱酯酶：根据酶的活性情况，用缓冲溶液溶解，3分钟的吸光度变化DA0值应控制在0. 3以上。摇匀后置4℃冰箱中保存备用，保存期不超过四天。

　　2.10.5可选用由以上试剂制备的试剂盒。乙酰胆碱酯酶的DA0值应控制在0. 3以上。

　　2.11仪器

　　2.11.1分光光度计或相应测定仪

　　2.11.2常量天平

　　2.12分析步骤

　　2.12.1样品处理：选取有代表性的蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取样品1g，放入烧杯或提取瓶中，加入5mL缓冲溶液，振荡1~2分钟，倒出提取液，静置3~5分钟，待用。

　　2.12.2对照溶液测试：先于试管中加入2.5mL缓冲溶液，再加入0.lmL酶液、0.1mL显色剂，摇匀后于37°C放置15分钟以上。加入0.lmL底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录初始吸光度A1和反应3 min时的吸光度A2，A2-A1=DA0。

　　2.12.3样品溶液测试：先于试管中加入2.5mL样品提取液，其它操作与对照溶液测试相同，记录初始吸光度A1和反应3 min时的吸光度A2，A2-A1=DAt。

　　2.13结果的表述计算

　　2.13.1结果计算

　　检测结果按公式计算：抑制率(%)=[ (DA0-DAt)/ DA0]×100

　　式中：DA0——对照溶液反应3分钟吸光度的变化值；

　　DAt——样品溶液反应3分钟吸光度的变化值；

　　2.13.2结果判定

　　结果以酶被抑制的程度(抑制率)表示。

　　当蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50%时，表示蔬菜中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在，样品为阳性结果。阳性结果的样品需要重复检验2次以上。

　　对阳性结果的样品，可用其它方法进一步确定具体农药品种和含量。

　　2.14附则

　　2.14.1酶抑制率法技术指标

　　2.14.1.1灵敏度指标：酶抑制率法对部分农药的检出限见表2。

　　表2酶抑制率法对部分农药的检出限(mg/kg)

　　2.14.1.2符合率：在检出的抑制率≥50%的30份以上样品中，经气相色谱法验证，阳性结果的符合率应在80%以上。

　　2.15说明

　　2.15.1干扰物资与排除方法与方法一(纸片法)相同。

　　2.15.2当温度条件低于37°C，酶反应的速度随之放慢，加入酶液和显色剂后放置反应的时间应相对延长，延长时间的确定，应以胆碱酯酶空白对照测试3分钟的吸光度变化DA0值在0.3以上，即可往下操作。注意样品放置时间应与空白对照溶液放置时间一致才有可比性。胆碱酯酶空白对照溶液3分钟的吸光度变化DA0值＜0.3的原因：一是酶的活性不够，二是温度太低。

　　2.15.3当吸光度大到无法读取时，说明测定液浑浊有干扰。

　　2.15.4在气相色谱分析仪还未问世及分布较少时，对有机磷类农药的检测即采取了酶抑制分光光度法，只是由于当时酶的纯度不够高、灵敏度较低、酶试剂保存期短、及方法不能区分出具体的农药而被气相色谱法所取代。而今用其作为快速分析则恰到好处。只是现在酶试剂的质量还应进一步提高，有效保存期应设法延长。由于这两个现实情况，在实验前，必需测试酶的活性，达到要求后才能往下进行。