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Southern 杂交操作步骤及注意事项

2019.11.13

Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上,与标记的核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。但由于该技术的操作比较烦琐、费时,所以现在有一些其他的方法可以代替Southern 杂交。但该技术也有它的独特之处,是目前其他方法所不能替代的,如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。

一、基因组DNA的限制酶切

根据实验目的决定酶切DNA的量。一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液,并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。为保证消化完全,一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。消化的DNA浓度不宜太高,以0.5μg /μl 为好。由于内切酶是保存在50%甘油内的,而酶只有在甘油浓度<5%的条件下才能发挥正常作用,所以加入反应体系的酶体积不能超过1/10。

具体操作如下:在1.5ml离心管中依次加入

DNA(1μg /μl)              20   μg
  10×酶切buffer                4.0 μl
  限制性内切酶(10U/μl)        5.0 μl
  加ddH2O                    至 500  μl

在最适温度下消化1-3hr。消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。如果消化效果不好,可以延长消化时间,但超过6hr已没有必要。或者放大反应体积,或者补充酶再消化。如仍不能奏效,可能的原因是DNA样品中有太多的杂质,或酶的活力下降。

消化后的DNA加入1/10 体积的0.5M EDTA,以终止消化。然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提,2.5倍体积乙醇沉淀,少量TE溶解(参见DNA提取方法,但离心转速要提高到12000g,以防止小片段DNA的丢失)。

如果需要两种酶消化DNA,而两种酶的反应条件可以一致,则两种酶可同时进行消化;如果反应条件不一致,则先用需要低离子强度的酶消化,然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度,再加第二种酶进行消化。

二、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法,制备简单,分离范围广(200bp-50kb),实验成本低。下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的DNA片段范围。

表:不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围

表:不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围

琼脂糖凝胶浓度(%) 分离DNA片段范围(kb)
0.3 5-60
0.6 1-20
0.7 0.8-10
0.9 0.5-7
1.2 0.4-6
1.5 0.2-3
2.0 0.1-2

1. 制备0.8%凝胶:一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。

2.  电泳:电泳样品中加入6×Loading 缓冲液,混匀后上样,留一或两泳道加DNA Marker。1-2V/cm,DNA从负极泳向正极。电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时,停止电泳。取出凝胶,紫外灯下观察电泳效果。在胶的一边放置一把刻度尺,拍摄照片。正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带,照片摄入刻度尺是为了以后判断信号带的位置,以确定被杂交的DNA长度。

三、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物

转移就是将琼脂糖凝胶中的DNA 转移到硝酸纤维膜(NC膜)或尼龙膜上,形成固相DNA。转移的目的是使固相DNA与液相的探针进行杂交。常用的转移方法有盐桥法、真空法和电转移法。这里介绍经典的盐桥法(又称为毛细管法)。

1. 试剂准备

① 变性液:0.5M NaOH;1.5 M NaCl。
  ② 中和液:1M Tris-HCl(pH 7.4);1.5M NaCl;
  ③ 转移液(20×SSC): NaCl 175.3g;柠檬酸三钠82.2g,NaOH 调pH 至7.0,加ddH2O至1000ml。

2. 操作步骤

① 碱变性:室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。
  ② 中和:将凝胶转移到中和液15min。
  ③ 转移  按凝胶的大小剪裁NC膜或尼龙膜并剪去一角作为标记,水浸湿后,浸入转移液中5min。剪一张比膜稍宽的长条Whatman 3mm滤纸作为盐桥,再按凝胶的尺寸剪3-5张滤纸和大量的纸巾备用。按下图所示进行转移。( 转移过程一般需要8-24hr,每隔数hr换掉已经湿掉的纸巾。转移液用20×SSC。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物。)
  ④ 转移结束后取出NC膜,浸入6×SSC溶液数min,洗去膜上沾染的凝胶颗粒,置于两张滤纸之间,80°C烘2hr,然后将NC膜夹在两层滤纸间,保存于干燥处。

四、探针标记

进行Southern 杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。放射性标记灵敏度高,效果好;地高辛标记没有半衰期,安全性好。这里介绍放射性标记。

探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法,有一些试剂盒可供选择,操作也很简单。

以下为Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤:

1. 取25-50ng模板DNA于0.5ml离心管中,100℃变性5min,立即置冰浴。

2. 在另一个0.5ml离心管中加入:

Labeling 5×buffer   (含有随机引物)            10μl
  dNTPmix  (含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mM)                         2μl
  BSA(小牛血清白蛋白)              2μl
  [a-32P]dATP                       3μl
  Klenow酶                          5U

3. 将变性模板DNA加入到上管中,加ddH2O至50μl,混匀。室温或37℃ 1hr。

4. 加50μl 终止缓冲液终止反应。

标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用。由于a-32P的半衰期只有14天,所以标记好的探针应尽快使用。探针的比活性最好大于109计数/分/μl


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