ELISA原理与分类介绍（九）
6．洗板
固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。洗板对于ELISA测定来说，也是极其关键的一步。洗液尽量不要溢出孔外；加洗液后要静置1分钟，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及时更换吸水纸，尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去，否则可能影响试验结果。
7．边缘效应
使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深。经研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。
8．显色
显色一定要控制时间,根据试剂盒说明操作即可。一般来说，显色时间过短，结果偏低；显色时间过长，空白增高或者非特异性显色增加。
9．比色
比色要注意波长的选择。以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求随时更换。因此，容易出现滤光片错用的问题。
其次，单波长或双波长比色选择的问题。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。
综上所述，尽管ELISA测定的操作步骤非常简单，但有可能会影响测定结果的因素却较多，分布在测定操作的各步之中，尤以加样、温育和洗板为甚。为帮助大家分析查找测定中出现问题的可能原因，特对常见问题及原因归纳总结于下表。
操作过程中可能出现的问题和解决方法
问题 | 可能原因 | 解决方法 |
显色淡， 灵敏度偏低 | 1、试剂盒在运输途中时间太长，温度太高 | 尽量缩短运输时间，夏季应放冰块降温 |
2、试剂盒未充分平衡 | 试剂盒从2～8℃冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约25℃）。 | |
3、培养箱温度不足37℃ | 注意培养箱温度，放入反应板后尽量减少开启次数以免影响温度恒定，非隔水式培养箱尤其应注意 | |
4、保温时间不足 | 校正定时钟准确定时 | |
5、洗涤时冲击力太大、浸泡时间过长、洗涤次数增加 | 按说明书要求保留洗涤时间，准确记住洗涤次数 | |
6、移液器吸液量不足，吸嘴内壁挂水太多或内壁不清洁 | 校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密，吸嘴内壁要清洁，最好一次性使用 | |
7、蒸馏水水质有问题 | 使用新鲜合格的蒸馏水 | |
8、底物作用时间不足 | 准确定时 | |
背景深， 全部呈有色 | 1、洗涤不充分，洗后未拍干，样品中其它成分残留或酶标记物残留 | 浓缩洗液准确配制；10倍浓缩洗涤液如有结晶则应让结晶于室温全部溶解后再量取稀释；充分洗涤，彻底拍干。加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染 |
2、样品污染 | 样品应新鲜采集，或低温保存，防止污染 | |
3、培养箱温度超过37℃或反应时间过长 | 调整培养箱温度，准确定时 | |
4、吸嘴重复使用，未洗净或消毒不彻底 | 吸嘴尽可能一次性使用 | |
5、蒸馏水被污染 | 使用新鲜蒸馏水 | |
6、酶等试剂混用 | 不同批号试剂勿混用 | |
7、一次实验的标本量过多，加样时间长，导致实际反应时间延长 | 合理安排实验，避免几块酶标板同时加样 | |
重复性不佳 | 1、样品数量多少不一，加样时间有长有短 | 重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近 |
2、保温时间不一致，洗涤条件不一致，操作人员不一致 | 重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性 | |
3、加样量不一致 | 样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴 | |
出现白板，阳性对照不显色 | 显色液变质 | 更换新的显色液 |
洗涤液配制有误 | 请按说明书所示稀释倍数配制 | |
未加酶结合物而认为已加入 | 注意不要漏加 | |
终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用 | 每次加液前均应看清标签 |
