新一代非基于“桑格技术”的基因测序法以空前的快速测序速度问世了，它为人类带来了重大的科学成果和先进的生物学应用软件。然而，要研发出新一代基因测序法，必须克服30年来以桑格技术为基础的惯性思维。

1977年，Fred Sanger 和Alan R. Coulson发表了两篇关于快速测序技术的论文[1,2]，该技术能够破译完整基因片断和整个基因组，大大促进了生物学的发展。该技术是以Sanger 和Coulson发现的加减法原理（1975年）为基础，大大减少了化学毒性物质以及放射性同位素的处理，取代同年早期Maxam和Gilbert[3]发明的化学降解法成为近30年来唯一的DNA测序法[4]。

应用桑格技术的哺乳动物基因组测序中心拥有工厂式全套设备以及大量工作人员。（图片来源：Maria Nemenuk, Broad Institute）

完成人类基因组计划的终极目标需要大量基因序列，这种需求推动了测序技术的发展，例如毛细血管电泳仪的出现。实验自动化和程序并行化导致了一些拥有大规模测序设备与专家小组的测序中心出现。尽管目前已完成了两个不同的人类基因组计划，但是生物学家渴望知道更多的基因序列，更重要的是，他们希望有更经济的测序技术。

2005年，介绍合成测序（sequencing-by-synthesis）方法（454生命科学公司研发[5]）以及自动测序软件（George Church实验室研发[6]）的划时代性论文发表是测序市场创新的第一个标志。这两种测序技术应用铬铁尖晶石板或者琼脂糖薄板同时分析序列，与同期Sanger毛细管测序仪（极限为96个样本）相比，具有以更小的反应体积产生更多的序列数据的优势。

454公司首推的测序仪能轻易的产生与50台以上的全自动化3730XL毛细管测序仪（Applied Biosystem's 3730XL capillary sequencers）相当的序列数据，成本花费却只是后者的1/6左右。尽管如此，科学界对这项新技术却并不热衷。许多习惯用桑格技术的科学家怀疑新技术的准确度、阅读能力、成本消费、实用性。代理Sanger型测序硬件的经销商害怕其投资失败而首先提出了这些怀疑。

批评家为新测序技术的推广设置了种种障碍，然而大多数人却忽略了一个事实，即桑格技术的普及最初也遇到同样的阻碍。桑格技术刚开发出来时，阅读能力很难超过25bp，即使在Fred Sanger双脱氧终止法发明后也只达到80bp，如今却达到了750bp；而新发展的合成测序技术，应用焦磷酸测序方法，其阅读能力最初只有100bp，推向市场16个月后增加至250bp，随着技术的不断完善，目前已达到了400bp，很快就接近桑格技术目前的水平。

除了阅读能力外，能否以有限的成本用一台仪器产生足够数量的序列标记也是另一个需要改善的重要问题。这个问题已经被454公司解决了，应用他们的系统，仅花费阅读35bp或者更小片段的成本就能产生比35bp多10倍的序列标记。当今，抢滩新一代测序市场的仪器主要有三种：罗氏公司的454 GS FLX测序仪，Illumina公司的Solexa 1G测序仪和最新开发的全自动生化SOLiD系统，以及VisiGen公司和Helicos公司预期最近两年内推出的第三代（也叫新二代）单分子测序技术。

尽管Margulies等人[5]应用原理论证了应用一台或者两台仪器能分析中小型细菌基因组，但大多数人不相信应用焦磷酸测序方法可以弥补桑格技术的不足。最初，罗氏454 GS20测序仪被用来对细菌基因组再测序或者为正在进行的庞大的“桑格工程”补充数据。这项工程初步阶段需要做环境基因组学研究，不仅需要分析比人类基因组大得多的序列数据，而且要解决文库构建和克隆产生的取舍偏差等问题。这个时候，454技术利用乳滴PCR结合焦磷酸测序的优势迅速的打开了市场。乳滴PCR将单个DNA片段分子的扩增片段分配到一个乳滴中，从而提高了产物的纯度。另一方面，焦磷酸测序利用计算机高通量检测反应中产生的光信号。2006年，早期研究公开证实了新一代测序仪的多功能性能够为深矿的微生物[7]、深海中的稀有生物圈[8]或者海洋中的有毒微生物进行基因测序[9]。

在2005年末，一个进行环境基因组学与古生物DNA研究[10]的科研小组仅用一台罗氏（454）GS20测序仪就分析出了28,000年前长达13Mb的长毛象基因组[10]，从而为完成更有挑战性的计划——解密穴居人基因组铺垫了道路[11,12]。解密古人类基因组比解密古象基因组更难，因为从可用的样本中提取的穴居人DNA数量不到从现代人样本中提取量的5%。因此，进行古人类基因组计划需要比进行现代人基因计划多20多倍的序列测定工作量。