5.7.1 分析方法

间 的 底 物 孵 育 会 延 长 信 号 持 续 时 间 。使 用 W e s t P i c o 或 W e s t D u r a 底 物 能 检 测 到 低 至10 n g 的 蛋 白 质 , 甚 至 在 完 成 蛋 白 质 印 迹 的 64 h 后 依 然 可 以 检 测 到 信 号 。 W e s t D u r a 比W est P ic o 的 底 物 更 敏 感 和 持 久 。尽 管 W e s t D u r a 在 检 测 5 n g 蛋 白 质 时 能 产 生 极 强 信号, 但泳道中含量超过 100 n g 会 导 致 信 号 迅 速 消 失 ，这 强 调 了 局 灵 敏 度 检 测 系 统 下 米 用适 量 靶 蛋 白 的 重 要 性 。

通 常 用 脱 脂 牛 奶 溶 液 孵 育 印 迹 以 最 小 化 背 景 信 号 。改 变 封 闭 液 中 牛 奶 的 浓 度 不 会 产生 假 带 。 令 人 吃 惊 的 是 ，封 闭 液 中 含 0 . 5 % 脱 脂 牛 奶 可 以 增 强 低 丰 度 蛋 白 质 的 检 测(图 33. 7A ); 然 而 ，抗 体 同 封 闭 蛋 白 质 的 交 叉 反 应 确 实 会 引 起 假 带 。如 果 一 抗 或 二 抗 同牛 奶 蛋 白 质 相 结 合 ，这 些 封 闭 的 位 点 化 学 发 光 ，产 生 深 色 背 景 ，而 样 品 蛋 白 质 集 中 于 膜 表面 ，形 成 白 色 条 带 (图 33. 7B )。

高 浓 度 的 酶 联 二 抗 与 大 量 靶 蛋 白 结 合 时 会 增 强 底 物 的 催 化 作 用 ，从 而 导 致 信 号 迅 速消 失 ，使 这 些 区 域 内 的 底 物 迅 速 耗 尽 。膜 上 转 移 的 大 量 蛋 白 质 可 与 大 量 H R P 连 接 的 二抗 相 结 合 。这 些 免 疫 复 合 物 集 中 区 域 内 产 物（也 就 是 信 号）的 过 度 产 生 会 使 底 物 迅 速 耗尽 ，造 成 假 带 。总 之 ，凝 胶 过 量 上 样 、二 抗 浓 度 过 高 、底 物 孵 育 未 达 到 最 优 化 的 时 间 ，以及抗 体 与 封 闭 区 的 交 叉 反 应 均 可 引 起 假 带 。在 使 用 髙 灵 敏 度 检 测 系 统 时 ，优 化 蛋 白 质 印 迹参 数 对 于 防 止 假 带 的 产 生 是 极 其 至 关 重 要 的

六、使用化学发光底物的印迹法和操作规程的优化

6.1 使 用 化 学 发 光 底 物 的 蛋 白 质 印 迹 法

(1) 凝胶电泳分离蛋白质样品。

(2) 制备转移缓冲液。采 用 4 〇 0 m L 超 纯 水 制 备 Tris— 甘氨酸转移缓冲液，再加人IOOmL 甲醇。 4°C 下 使 用 和 保 存 该 转 移 缓 冲 液 。注 ： 转 移 缓 冲 液 ： 25 mm 〇 I/LTris、192 mmol,L 甘氨酸 (pH8_ 0),2 0 % 甲醇。

(3) 为湿转移制作凝胶「三明治」(图 33.8)。对于半干的转移，在阴极和阳极间按同样的步骤制作三明治。， : 在三明治装配前将衬垫和滤纸浸泡在转移缓冲液中。

⑷将蛋白质从滅胶转移到膜上。湿转移时如果使用为 g cmX1 〇 c m 凝设计的迷你转移装置，则 40 V 转 移 90min, 并保持缓冲液温度为4 ℃ 。半干型转移时,15 v 转移90 min。注: 通过凝胶染色或膜可逆染色来确定转移是否成功。

(5) 取下膜』 在封闭缓冲液中室温 (R T ) 摇晃孵育 2 〇〜60 min ，以封闭膜上的非特异结合位点。

(6) 用 含 1 0 % 封闭液的一抗溶液孵育膜并振摇丄 h 。如果需要的话将印迹在 2〜8℃过夜孵育。

(7) 清洗 膜 3 次 ，每 次 5 min』 可 用 Tris-盐缓冲液 (TBS)、磷酸盐缓冲液 (pBS 域 其 他

(9) 清 洗 膜 5 次 ，每 次 5 m in 以除去未能结合的酶联物。酶联物孵育后彻底清洗膜是至关重要的。

(10) 制备底物。使用足量底物以确保膜完全浸湿 (0.1 mL/cm2), 且膜不能变干。

(11) 用电化学发光 (ECL) 孵 育 膜 I m in, 或 使 用 SuperSignal 底物孵育 5 m in。

(12) 将膜从底物中移出并放置在塑料片保护器内。尽管塑料保鲜膜也能起作用，但是硬质的塑料片做成的保护器作用更好。移除所有在膜和膜保护器表面之间的气泡。

(13) 通过胶片或冷 CCD 照相机进行印迹成像。

6.2 蛋白质印迹去除方案

采 用 化 学 发 光 底 物 的 众 多 好 处 之 一 个 就 是 能 够 移 除 所 有 检 测 试 剂（Kaufmannet al.,1087)。这些移除方法对于沉淀底物是无效的，并且用于荧光染料显色的膜时结果各异。

(1) 制备蛋白质印迹膜剥离液。使用下述剥离液中的一种：

① Restore W estern Blot Stripping Buffer(Therm o Fisher Scientific 公司产品）

② 0•I m o l / L 甘氨酸- H C K p H 2. 5〜3. 0);

③ 50 m m o l / L Tris-H C l (p H 7 ) 、2 % S D S 、50 m m o l / L D T T 。 注 : 现 配 现 用 。

(2) 将待除去印迹的膜放在蛋白质印迹剥离液中。使用足量溶液确保膜完全潮湿(每 8 c m X 10 c m 膜对应约 20 m L 剥离液)。注: 可能会出现一些靶蛋白的变性和损失。

(3) 室温孵育 5〜15 m in。为追求最佳结果，需要优化孵育时间和孵育温度。某些相互作用至少需要 15 m in, 可能还需要 37°C 孵育 。如果使用缓冲液③,70°C 孵 育 30 m in。

(4) 将印迹从蛋白质印迹膜剥离液中移出，用洗涤缓冲液清洗 (P B S / T B S 或其他含有 0.0 5 % T w e e n - 2 0 的生理缓冲液）。

(5) 要测试酶联物和一抗是否完全移除, 可进行下列实验。若两种情况下都能检测到信号，就重复步骤 (2)〜(4)，剥离时间额外增加 5〜15 m in 或 将 温 度 提 高 至 37°C 。优化去除时间和温度以确保在不损伤抗原的同时将抗体完全移除

① 要测试酶联物是否完全移除, 将膜用底物孵育并印迹成像。 5 m m 胶片曝光后若没有信号被检测到，那么表示酶联物已经被成功移除。

② 要测试一抗是否完全移除，将膜用酶联物赙育并用洗涤缓冲液清洗。再用底物孵育并印迹成像。 5 m in 胶片曝光后若没有信号被检测到，那么表示一抗已经被成功移除。

确定膜已经恰当地剥离以后, 开始进行第二次检测实验。通常，印迹可以被剥离和再检测数次, 但可能会需要更长的曝光时间或更敏感的底物。如果抗原不稳定, 之后的再检测可能会导致信号衰减。需要对单独系统进行分析。注: 剥离后通常不需要再次封闭薄膜 ，但在某些系统中却需要这么做。

6.3 抗 原 來 度 的 优 化

(1) 用 SDS^ A G E 样品缓冲液制备不同浓度的蛋白质样品。测试较大范围的蛋白质浓度，需要注意所使用底物的检测极限。

(2) 凝胶中每种浓度的样品要等量，通过电泳进行分离。将样品转移到膜上。

注 ： 最佳浓度的粗指示可使用点印迹。使用尽可能少的量将抗原稀释物点在干燥膜条上。使膜干燥 5〜10 m in 或直到没有可见潮湿痕迹，再进行步骤 (3)。

(3) 用标准封闭试剂封闭膜，加入一抗, 随后将酶联物结合膜。如果还没有确定最优稀释度，就根据底物敏感度采用中等范围的稀释度。

(4) 清洗膜，加入底物。按要求进行印迹成像。

6.4 膜 封 闭 的 优 化

(1) 用电泳分离蛋白质样品并转移至膜上，或如先前所述将蛋白质样品点在膜上。

(2) 根据待测试的条件的个数，将膜条从膜上切下来。下述组合物应该用每一种封闭剂测试。①封闭剂+ —抗 + 酶联物+ 底 物 ；② 封 闭 剂 + 酶 联 物 + 底 物 ；③ 封 闭 剂 +底物。

(3) 将膜条加入到各种封闭液中, 确保其完全浸泡在溶液中。每个膜条都室温振摇孵 育 I h 。

(4) 在各组中加入含 10% 封闭剂的一抗和/或酶联物。如果还没有确定最优稀释度，就 根 据 底 物 敏 感 度 采 用 中 等 范 围 稀 释 度 。

(5) 清 洗 膜 ，加 入 底 物 。按 要 求 进 行 印 迹 成 像 。

注 ：将 封 闭 后 的 膜 用 底 物 孵 育 , 以 检 査 封 闭 剂 或 样 品 中 内 源 的 过 氧 化 酶 活 性 。如 果检 测 到 信 号 ，就 在 封 闭 步 骤 后 使 用 其 他 的 封 闭 缓 冲 液 或 使 用 过 氧 化 酶 抑 制 剂 。封 闭 缓 冲液 用 量 大 时 会 最 大 限 度 地 减 少 非 特 异 信 号 。

6.5 — 抗 农 度 的 优 化

( 1 ) 电 泳 分 离 蛋 白 质 样 品 并 转 移 到 膜 上 。或 者 ，如 本 章 6. 3 节 所 述 将 蛋 白 质 样 品 点在 膜 上 。用 适 当 封 闭 剂 封 闭 膜 。根 据 待 测 试 的 一 抗 条 件 的 个 数 将 膜 条 从 膜 上 切 下 来 。

(2) 在 含 1/10 体积封闭剂的清洗缓冲液中制备一抗的稀释液，并将其加人到膜条上 。室温孵育 I h。

(3) 清 洗 膜 条 ，室 温 下 用 酶 联 物 孵 育 l h 。再 次 清 洗 并 用 适 当 的 底 物 显 现 信 号 。用 胶片 或 C C D 照 相 机 检 测 信 号 。

注 ：先 用 一 抗 工 作 液 孵 育 膜 ，再 用 酶 联 物 工 作 液 孵 育 ，以 检 查 一 抗 与 封 闭 剂 的 非 特 异性 结 合 。如 果 观 察 到 信 号 ，通 过 使 用 其 他 的 封 闭 剂 或 较 少 量 的 一 抗 来 解 决 此 问 题 。

6.6 膜 清 洗 的 优 化

⑴ 使 用 洗 涤 缓 冲 液 ，如 P B S 或 T B S 或 其 他 含 0. 05% tween2 0 的 生 理 缓 冲 液 。

(2) — 抗 孵 育 后 , 振 摇 清 洗 膜 至 少 3 次 , 每 次 5 m m ; 酶 联 物 孵 育 后 ，振 摇 清 洗 膜 至 少 5次 ，每 次 5 m i n 。

(3) 如 果 在 最 终 检 测 中 出 现 非 特 异 性 背 景 ，使 用 更 大 量 的 洗 涤 缓 冲 液 或 增 加 每 次 清洗 的 用 量 和 时 间 。如 果 仍 没 有 改 善 , 问 题 就 在 于 其 他 变 量 。

6.7 酶 联 物 农 度 的 优 化

当检测一个新的蛋白质印迹系统的最佳浓度时， 一 个简单的实验通常可以补救许多因信号变动带来的问题。

(1) 在 3 个 (或更多) 凝胶孔中加入同样用量的目标物。

(2) 电泳分离蛋白质样品并转移到膜上。封闭非特异结合位点，结合一抗。

(3) 清洗后，将含目标物的印迹切成膜条。

⑷以不同酶联物浓度结合膜条。例如，X 寸于 SuperSignal West Pico Substrate 使用1 : 40 000、1 : 60 000 和 1 : 80 000 的稀释度 (取自 I mg/mL 储备液）。室温下振摇孵育条 带 I h。

(5) 清洗膜条，加入底物。底物孵育后，进行膜条成像。

(6) 等 待 1〜2 h，再次进行膜条成像。

(7) 结果评估。选取能产生最强信号的稀释度。

6.8 检 测 方 法 的 优 化

(1) 电泳分离蛋白质样品并转移到膜上，或 如 本 章 6. 3 节描述将蛋白质样品点在膜 上 。

(2) 封闭非特异结合位点，在 含 有 1/10 封闭剂的体系中结合一抗和酶联物。

(3) 如果抗体浓度尚未优化，选择一个中等范围的稀释度。每次孵育后都要清洗膜。

(4) 根据待测试的底物曝光条件的个数从膜上切下膜条。制备待测试的底物工作 液 。

(5) 以制造商说明为准，用底物孵育膜条一段时间。

(6) 用镊子将底物中的膜条移出，在纸巾上轻拍条带边缘以移除过剩的底物。

(7) 将膜条放在塑料薄膜上, 按不同时间长度对其成像。选取一个有清晰信号和低背景的时间。注:CCD 照相机可能比胶片需要稍长的曝光时间。