实验方法原理

实验材料 诱变转座子基因组文库质粒DNA

试剂、试剂盒 10×TE缓冲液 pH 8.0无菌 E. coli tets kans (如 DH5c×)14 cm的LB培养基平板培养基中加入3 mg mL的四环素和40μg mL的卡那霉素LB培养基丙三醇无菌NotⅠ非限制性内切核酸酶及缓冲液 Ura3_酵母菌培养一步（One~step)缓冲液10 mg mL的变性的鲑精DNACM缺失成分培养基平板和无尿嘧啶的培养基

仪器、耗材 临床用台式离心机、45℃水浴或孵育箱、无菌牙签、3MM无菌滤纸（Whatman)

实验步骤

1)溶液干了之后，从转座子诱变基因组文库的个体库里分配质粒DNA (每个库约为1μg DNA)。短时间离心每个干的样品，用pH 8. 0的TE缓冲液以合适的容积重悬每 个库的DNA (如每个库10体积)。文库DNA的每个库都被单独诱变；所以分开 处理每个库的DNA以保证得到独立插入等位基因。

2)从每个库中取适当的DNA的量，以标准的转化步骤转入对任何四环素 (tets)和卡那霉素（kans)敏感的大肠杆菌菌株内。

3)在加入3 pg/mL的四环素和40μg /mL的卡那霉素的直径为14 cm的LB培养基平板上挑选转化株。

4)通过在每个平板表面加6 mL的LB培养液洗脱转化株克隆并刮取细胞使成为均匀的 悬液。保存一部分悬液；-70℃下于15%的丙三醇里保存。

5)用100 mL含3μg /mL四环素和40μg /mL卡那霉素的LB培养基稀释1 mL这种洗脱 液，进行培养使细胞密度几乎达到饱和。在通风的条件下，37℃孵育2〜3h。

6)通过标准的小量制备或大量制备来分离质粒DNA。

7)用非限制性内切核酸酶NotⅠ消化来自每个库的小量（典型的量至少为 1μg)的质粒DNA (在步骤6中获得）。接下来为了确保mTn诱变的酵母菌DNA 从pHSS6载体上释放，取一部分反应混合物，用琼脂糖凝胶电泳法进行分析。剩余的反应混合物于4℃保存以备后用（见步骤10)。在电泳凝胶上可以看到一条清楚的2. 1kb的pHSS6条带和一条宽的8kb的mTn诱变的酵母菌基因组DNA条带。

8)取10 mL要用作研究的Um3-酵母菌株培液进行培养，使其处于对数生长期（密度为1O7细胞/mL或OD600约为1)保持适合的选择，以备应用。

9)临床用台式离心机于室温下1100 g将细胞离心5 min,用5体积的一步缓冲液洗涤沉淀物一次。

10)在1 mL的一步缓冲液里加入1 mg变性的鲑精DNA并重悬细胞，在装有0. 1〜1μL的从步骤7中得到的用非限制性内切核酸酶I消化的质粒DNA的微型离心管里加入100μL 的重悬液，在涡旋振荡器上振荡使其充分混合。

11)45°C孵育混合物30 min。

12)室温下微型离心机上以最大速度将细胞离心5 s，随后在400μL的CM (-Ura)缺 失成分培养基中重悬沉淀物。取200μL 重悬液加到CM (-Ura)缺失成分培养基平板上。30℃孵育3〜4天。

13)为了最大限度检测出在低水平表达的hcZ-融合产物，将转化克隆以每平板达到100个克隆的密度用无菌牙签转移到YPAD培养基平板上。

14)在CM(-Ura)缺失成分培养基平板上放置一个3 MM无菌滤纸圆片；在许多要用 的培养基平板上重复此操作。将转化态细胞复制到滤纸覆盖的平板上，以易于鉴定 YPAD培养基平板上相应的克隆（步骤13)，30℃孵育过夜。

其他生长条件（如在孢子形成培养基上生长）可以根据需要取代上述条件。

15)过夜生长后，从平板上拿起滤纸并放在一个9 cm的玻璃皿的盖子里。把这个盖子 放进盛有氯仿的一个15 cm的闭合的玻璃皿里。孵育10〜30 min溶解菌株。

16)将滤纸克隆面向上放在很薄的λ-gal培养基平板上，30℃转化孵育2天。

17)从步骤13得到的再生的YPAD培养基平板上找出产生λ-gal的克隆株（在λ-gal培 养基平板上表现为蓝染）。在以后的菌株生长和处理中保持适当的选择。

注意事项

其他

其他所需：

YPAD培养基平板：加入80 mg/L腺嘌呤的YPD培养基平板，氯仿，λ-gal培养基平板