lncRNAi方法通过靶向多个OncomiRs来实现HCC的肿瘤精准治疗

　　一箭N雕，lncRNAi实现肿瘤精准治疗

　　由于引起肿瘤的发生是一个复杂的网络，因此，是否可以通过一次靶向多个OncomiR进行肿瘤治疗呢？今天，小编通过一篇发表在《Molecular Cancer Therapeutics》上的研究，来看看科学家们怎么使用lncRNAi的方法，通过靶向多个OncomiRs来实现HCC的精准治疗。

　　研究背景

　　肿瘤的精准医疗是现在大家关注的热点，针对小分子的肿瘤靶向治疗是热点中的热点。已有研究表明，在肿瘤发生，增殖，转移过程中，存在着大量的异常表达miRNA，称之为“OncomiR”。而这些OncomiRs通过靶向下游mRNA，调控了功能基因的转录后调控。针对肿瘤细胞中过量表达的miRNA，通过miRNA抑制剂或者antisense 序列来人为降低miRNA的表达，是可以抑制肿瘤生长的，已有的研究也是从这个方向多发，抑制某一个miRNA的表达来实现肿瘤治疗。但是，这种方法的局限性在于，由于一个miRNA可以调控多个mRNA，而一个mRNA又受到不同的miRNA的调控，如果只干预了一个miRNA的表达，通常情况下是很难实现对整个调控网络的干预而导致治疗效果不佳。针对这样一个生物学问题，本研究通过lncRNAi的方式，人为合成一条长链非编码RNA，通过同时靶向多个不同的miRNA分子，来实现对HCC的精确治疗。这个方法是否可行呢？让我们一起往下看。

　　研究结果

　　1、HCC细胞lncRNAi模型建立与确认

　　为了同时干预多个OncomiRs，研究人员腺病毒载体构建了同时能靶向12个miRNA(miR21,miR221/222,miR224,miR17-5p/20a,miR10b,miR106b,miR151-5p,miR155,miR181a/181b,miR184,miR1和miR501-5p)，AdSVPE1a-lncR。结果显示，在HepG2,Hep3B,MHCC97H，Huh-7和PLC/PRF /5细胞系中都能表达，而在正常肝细胞系WRL-68和L02中不能表达。HepG2, Hep3B,MHCC97H, Huh-7, PLC/PRF/5 SMMC-7721, MHCC97L细胞中能检测到高的E1a表达，而在BEL-7402, WRL-68, L02细胞中表达很弱。在SMMC-7721和MHCC97L细胞中，AdSVPE1a-lncR的复制水平有成百倍，而在正常细胞系L02和WRL-68中复制水平很低。因此，研究人员成功的将lncRNAi体系在HCC细胞系中实现了表达。

　　2、lncRNAi下游靶基因影响鉴定

　　qRT-PCR检测显示，AdSVPE1a-lncR–mediated lncRNAi表达水平在Huh-7,Hep3B和HepG2细胞中比较高，在PLC/PRF/5, MHCC97H, BEL-7402,MHCC97L, and SMMC-7721相对比较低，而在WRL-68和L02细胞中很低。那么，lncRNAi是否可以影响下游miRNA及靶基因表达呢？结果显示，miR21和miR17-5p在HepG2细胞中显著抑制，相应的靶基因PTEN有明显上调。进一步的荧光素酶检测也表明pGL3-miR21/17-5p在HepG2相比L02细胞表达明显低。因此，lncRNAi可以抑制OncomiRs来保护下游靶基因。

　　3、lncRNAi影响HCC细胞的增殖和迁移能力

　　lncRNAi在细胞中能起作用，那么会影响哪些细胞的生物学功能呢？结果显示，AdSVPE1a-lncR有非常显著的Hep3B和Huh-7细胞杀伤能力。在Hep3B细胞中加入MOI=0.5 pfu/cell ，细胞存活不到50%，加入MOI=2 pfu/cell，细胞存活不到10%。在其他细胞系，HepG2,MHCC97L,PLC/PRF/5,MHCC97H和SMMC-7721细胞在加入MOI=100 pfu/cell时，存活也少于50%。但是，对BEL-7402细胞的细胞杀伤却不显著，对正常肝细胞系没有显著杀伤力。因此，lncRNAi只有对肿瘤细胞具有杀伤力，影响其增殖能力。细胞迁移和侵袭能力检测也表明，AdSVPE1a-lncR能显著抑制HepG2, MHCC97H, PLC/PRF/5, Hep3B, Huh-7细胞的迁移和侵袭能力，而在BEL-7402, SMMC-7721, MHCC97L细胞中的抑制能力相对较弱。因此，lncRNAi显著抑制了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。

　　当HCC细胞感染AdSVPE1a-lncR后，PLC/PRF/5, Hep3B, Huh-7细胞滞留在G0-G1阶段。PLC/PRF/5 ,Hep3B细胞滞留在G2-M阶段。HepG2和 MHCC97H细胞滞留在S阶段。但是，BEL-7402, SMMC-7721, MHCC97L的细胞周期影响较弱。

　　另外，在这些感染细胞中，所有细胞系的细胞凋亡比率显著增加，而BEL-7402，WRL-68和L02细胞的凋亡比率不显著。因此，lncRNAi只会影响HCC细胞的凋亡过程。

　　4、 lncRNAi作用分子机制探究

　　既然HCC细胞的生物学功能发生了变化，那么，其内在的分子机制是什么呢？通过对AdSVPE1a-lncR ，AdSVPeGFP-lncR（对照）感染细胞系全基因组表达谱筛选（由上海伯豪提供），发现AdSVPE1a-lncR感染的4个不同细胞系有2091个差异基因，而AdSVPeGFP-lncR只有101个差异。其中，271个共有上调和176个共有下调基因中，上调基因主要是凋亡诱导基因和增殖抑制基因。Western blot实验也验证PTEN和p27kip1显著增加。

　　AdSVPE1a-lncR感染后mRNA发生变化，miRNA是否也有变化呢？通过全基因组miRNA表达谱芯片检测，研究人员发现HCC细胞中有大量的miRNA表达发生改变。

　　qRT-PCR显示，只有miR21在所有的HCC细胞中都表达下调。

　　5、lncRNAi作用效果体内实验验证

　　细胞实验表明lncRNAi确实对肿瘤细胞产生效果，芯片检测也表明改变的基因和miRNA也确实和增殖凋亡相关。那么，这样的效果在体内是否也一致呢？将AdSVPE1a-lncR治疗后的Huh7和HepG2细胞移植裸鼠，21天后，治疗组肿瘤体积减小。同时，Huh-7细胞移植模型的肿瘤质量在治疗后也明显低于对照。

　　进一步的实验和免疫组化检测也表明miRNA靶基因PTEN和p27kip1表达显著增加，而CDK4，p38/MAPK，Survivin表达显著降低。

　　为了更进一步的确认体内作用效果，研究人员用病人样本的PDX小鼠模型进行了实验。结果显示，治疗28天后，肿瘤质量显著减少。治疗后，miRNA的靶基因PTEN表达显著增加，Survivin表达显著降低。因此，基于AdSVPE1a-lncR的lncRNAiHCC肿瘤治疗确实能够起到作用效果，是一种潜在的HCC治疗方法。

　　研究结论

　　该研究采用lncRNAi的方法，在HCC细胞中同时靶向多个高表达miRNA，从而通过保护下游靶基因实现对肿瘤的治疗，从细胞角度，基因层次和体内小鼠模型实验确实表明lncRNAi能够用来治疗HCC，该研究为肿瘤的精准医疗提供了一种新的方法，值得大家学习参考。

　　原文出处：Li X, Su Y, Sun B, Ji W, Peng Z, Xu Y, Wu M, Su C.An Artificially Designed Interfering lncRNA Expressed by Oncolytic Adenovirus Competitively Consumes OncomiRs to Exert Antitumor Efficacy in Hepatocellular Carcinoma.Mol Cancer Ther. 2016 .

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