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吸光度的线性度有多重要？
作者：Rob Morris，美国海洋光学
光谱仪的高性能吸光度线性一直限于复杂和昂贵的仪器。现在，像Ocean ST这样更简单、更容易获得的光谱仪正在实现可比较的测量结果。
在这份应用报告中，我们评估了Ocean ST微型光谱仪在蛋白质和DNA测量中的吸光度线性。Ocean ST是最近发布的光谱仪，以其出色的紫外响应（185-650纳米）、高信噪比性能和超紧凑的尺寸（比智能手机还小）而著称。
背景介绍
为什么是吸光度？吸光率测量提供了关于材料化学成分的宝贵信息。入射到样品上的光可以是透射的，吸收的或散射的。透射是指通过样品的光；遇到分子的光可以被吸收或散射。吸光率可以作为一种定性工具来识别物质，或作为一种定量工具来测量溶液中分子的浓度。
吸光度在一系列应用中是一项重要技术，特别是在生物医学和生命科学领域，研究人员、开发人员和工艺工程师将吸光度技术应用于从蛋白质分析到护理点诊断的各种挑战。
吸光率的线性度
光谱仪测量精度的一个指标是其吸光度的线性。这在比尔定律中有所描述，一个在给定波长下吸收光的溶液将在该波长下产生一个吸光峰，其强度随着溶液浓度的变化而线性变化。例如，如果溶液浓度增加一倍，吸光峰的高度也会增加一倍。因此，当我们描述一个光谱仪在2AU（吸光度单位）以下具有吸光度线性时，这表明在2AU以上，样品浓度和吸光度峰值之间的关系会破裂（不再是线性的）。这种破裂与限制因素有关，包括检测器的噪声和杂散光。
具有高吸光度线性的光谱仪使用户能够：1）在广泛的浓度水平上准确测量样品；2）不需要高度参与的样品稀释步骤，这些步骤有可能在测量过程中引入误差。这对于需要非常高的测量精度的应用来说是非常关键的，因为你想比较一个实验和另一个实验的结果，或者你有有限的样品量可以使用。
使用Ocean ST的蛋白质和DNA的吸光度
为了评估Ocean ST的吸光度线性，我们测量了牛血清白蛋白（BSA）和DNA oligo。BSA是一种常用于生化应用的蛋白质，寡聚物是合成的DNA或RNA，常见于包括基因测试和医疗诊断在内的各种应用。
设备设置
我们使用Ocean ST-UV（185-650纳米），积分时间设置为3.8毫秒，扫描平均为100次，箱体宽度设置为3。在测量之前，光谱仪和光源被预热了30分钟，以确保热稳定性。
下面是其余的设置。
DH-2000-S-DUV-TTL深紫外氘灯和卤钨光源。在这些实验中，我们只使用氘灯。卤素灯在所有测量中都是关闭的。
SQ1-ALL比色皿支架。这是一个通用的比色皿支架，适用于1厘米比色皿。
CV-Q-10 1厘米（10毫米）路径长度的石英比色皿。石英比色皿是紫外测量的最佳选择。
QP450-1-XSR极端耐晒光纤（数量2）。这些是450微米的SR光纤，带有不锈钢BX护套。
样品制备和测量
我们测量了30个BSA（Sigma A2153）的浓度，从0.02到5毫克/毫升，以及35个oligo DNA（Sigma D-3159）的浓度，从0.3到150微克/毫升。所有的稀释都是直接在石英比色皿中进行的，从比色皿中取出0.5mL样品，向比色皿中加入0.5mL蒸馏水，然后通过轻轻地将样品移入和移出尖端3次来混合样品。在测量过程中，石英比色皿没有从比色皿支架上移开，这有助于将污染物或比色皿对准问题造成的潜在误差降到最低。
结果
对BSA的吸光度测量显示了吸光度在2AU以下的线性，超过了我们对Ocean ST的预期（图1）。这具有非常积极的意义，因为BSA是一种典型的蛋白质，在生命科学研究和发展的许多领域都有应用。
图1. Ocean ST微型光谱仪在广泛的蛋白质浓度水平上显示了显著的吸光度线性。
同样，Ocean ST对DNA oligo的测量也取得了令人印象深刻的吸光度线性结果（图2）。这表明Ocean ST对寡头用户和定制寡头生产都有价值，前者是一些分子生物学研究和开发工作的起点，后者则是在制造过程中使用紫外可见光谱作为量化步骤。
图2. 用Ocean ST微型光谱仪展示的吸光度线性通常与更复杂、更难获得的光谱仪有关。
（注：Yvette Mattley博士为本应用说明提供了测量数据。）
