山东美正生物科技有限公司
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【应用分享】肝素亲和柱全自动净化-液相法建立奶粉中乳铁蛋白的检测方法
本应用采用美正MUTIPURE多功能净化仪结合高效液相色谱-紫外检测器（HPLC-UV）建立了婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白的检测方法。
样品经磷酸盐缓冲溶液提取，肝素亲和柱富集净化，C4色谱柱分离，外标法进行定量。结果表明，添加量为400 mg/kg时，乳铁蛋白回收率在85% ~ 90%，能够满足检测要求。
实验部分
主要仪器设备
Aglient 1260高效液相色谱-紫外检测器。
MUTIPURE多功能净化仪。
试剂材料
0.1%三氟乙酸溶液：量取三氟乙酸1 mL，加水定容至1000 mL，混匀；
结合缓冲液：称取30.083 g十二水合磷酸氢二钠，2.496 g二水合磷酸二氢钠，加900mL水溶解，加入20mL乳铁蛋白提取试剂A（50倍浓缩液，肝素亲和柱包装盒中），最后用水定容至1000 mL混匀；
洗脱液：称取7.52 g磷酸氢二钠，0.624 g磷酸二氢钠，29.2 g氯化钠，加400 mL水溶解，定容至500 mL混匀；
乳铁蛋白标准储备液（10 mg/mL）：准确称取按其纯度折算为100%质量的乳铁蛋白各0.1 g于10 mL容量瓶中，加水溶解后定容至刻度；
肝素亲和柱：3 mL（P/N：QC0140）。
样品制备
1、样品提取
精确称量2.5 g样品于离心管内，加入结合缓冲液30 mL，涡旋振荡至样本全部溶解，再加入结合缓冲液定容至50 mL，混匀，11000 r/min 4℃离心15 min，立即吸取25 mL中间层试液于另一50 mL离心管内，11000 r/min 4℃离心15 min，立即取出中间层至15 mL离心管，恢复至室温后待净化。
2、样品净化
将上述待净化液按顺序连接上样管，再取15 mL离心管依次置于收集架上，将肝素亲和柱连接在MUTIPURE多功能净化仪上（如下图），按照下表的指令设置方法，启动仪器，由仪器自动完成净化步骤。
肝素亲和柱连接在MUTIPURE多功能净化仪
MUTIPURE多功能净化仪仪器参数
后处理:涡旋混匀，离心5 min，取上清液上机待测。
色谱条件
色谱柱：DAISOPAK SP-300-5-C4-BI0，4.6 × 250 mm；
流动相A ：0.1%三氟乙酸溶液；
流动相B : 乙腈；
柱 温：30℃；
波 长：280 nm；
进样量：30 µL；
流 速：1 mL/min；
梯度洗脱见下表。
液相色谱梯度洗脱条件
实验结果
乳铁蛋白加标回收实验结果（添加水平400 mg/kg，n=4）
实验谱图
40 µg/mL乳铁蛋白标准溶液色谱图
婴幼儿奶粉基质空白色谱图
400 mg/kg婴幼儿奶粉基质加标色谱图
实验结论
本实验采用MUTIPURE多功能净化仪结合高效液相色谱-紫外检测器对于加标量为400 mg/kg的婴幼儿奶粉进行检测。
结果表明，使用MUTIPURE多功能净化仪对婴幼儿奶粉基质进行净化，乳铁蛋白回收率满足要求且RSD小于10%，说明MUTIPURE多功能净化仪适用于婴幼儿奶粉中乳铁蛋白的检测，且方法稳定。
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