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如何实现快速、稳定的多色活细胞成像

MICA如何帮助用户研究活细胞和动物

 

研究人员在活细胞成像技术的帮助下,可以深入了解活细胞甚至完整生物体的动态过程,这包括细胞内和细胞外活动。一些代表性的示例包括蛋白质或脂质转运、免疫细胞迁移,类器官的细胞组织等。活细胞成像要求样本和显微镜系统具备特定的属性。在这篇文章中,我们描述了MICA对这些先决条件的具体调整,并提供了合适的示例。


活细胞成像

活细胞成像在微观层面揭示了生物过程的信息。它要求将标本保存在接近生理的条件下。下一段介绍了部分条件。典型的样本包括细胞培养物、活组织、类器官或模式生物,通常使用荧光显微镜研究这类样本。为此需要转染细胞,从而产生表达荧光标记蛋白质的转基因体。此外,还可以使用活细胞染料。

挑战

环境条件:

为尽可能获得接近真实状态的实验结果,活细胞成像条件必须模拟生理环境。不同的生物体所需的生理条件也不同,包括温度、pH、氧气含量等。例如,哺乳动物细胞要求的温度是37°C左右,昆虫细胞的最佳温度是27°C,鱼为28°C,而裂殖酵母则为30°C左右。

在碳酸氢钠缓冲液的帮助下,细胞培养基内的pH值持续保持在7.0-7.4,这就要求培养箱环境中相应地存在二氧化碳。此外,培养箱的环境应该是水饱和的,这样就不会有培养基蒸发了。

体内不同组织和细胞类型的氧含量不同。有趣的是,目前细胞培养箱和活细胞成像并没有广泛考虑氧的问题。不理想的氧气水平会导致增殖率下降(高氧)或代谢率降低(低氧)(Hadanny, A.; Efrati, S.)

光保护是活细胞成像的另一个挑战,因为光照射可以影响活细胞本身以及荧光团。例如,强光可以导致DNA损伤或光漂白荧光团。

MICA的设计旨在应对所有这些挑战:

外壳本身就像一个培养箱。这意味着样本周围空间被加热到所需的温度(比室温高5°C,最高42°C),并平衡到所需的二氧化碳浓度和湿度。

如果需要的话,氧气浓度可以在一个额外的载物台顶部腔室中控制。所有的参数均可通过MICA LAS X软件控制。样本的曝光由OneTouch功能设置,并可通过“样本保护-图像质量”滑块进行调整,以平衡所需的信号量与保护活细胞和荧光团。

为了在最小的环境干扰下获取样本,在前门中隐藏有一个小的服务挡板。

图1:MICA是一个培养箱。盖子下面的整个空间被平衡到所需的温度、湿度和二氧化碳浓度。为了快速检查样本或操作,前盖可以折叠下来,一个小的服务挡板可以滑开。

光可能是有毒的

由于光是带入样本的能量,它可能有负面的影响。任何光都可能干扰细胞内的分子,例如紫外线可能伤害皮肤。此外,荧光团可能形成与分子相互作用的自由基。光的负面作用被称为光毒性。挑战在于能产生足够的信号来解答科学问题的足够光量与尽量减少光毒性的平衡。MICA通过提供一个工具来帮助用户在不需要了解技术背景的情况下精确地平衡这两件事——保护-质量滑块。只需点击一下,OneTouch将根据滑块上的选择设置所有的激发和检测参数。

细胞内的动态变化可能非常快。例如,携带细胞器或囊泡的分子速度可达几微米/秒(Alberts B.等人)。这影响了对图像采集的要求,特别是当需要对多个荧光团进行成像时。这里的问题是,生物不会暂停所有的荧光通道从而在相同的状态下进行采集,而是持续不断进行。在一个经典的基于荧光过滤器的系统中,通常最耗时的步骤是为不同的通道更换滤光片。这导致实验中两个荧光团在两个不同的时间点被监测,导致无法实现精确的时空相关性。

MICA FluoSync™技术使用户能够同时获得多达四个荧光通道。这意味着不同的囊泡、细胞骨架和运动蛋白可以以100%的时空相关性进行成像。此外,同步采集使成像时间点的节奏更快,因此,可以用更灵敏地记录快速的细胞运动。

在给定的时间范围内记录许多重复的情况

在一个实验中记录许多次重复可能是一个挑战。假设用户想每10分钟记录一次,那么在下一个周期开始之前,只能记录一定数量的位置。通常情况下,如果您想在同一位置记录多个标签,就会有更多限制,但MICA不存在这个问题。FluoSync™技术使用户能够以四倍的速度记录,因为它最多可以同时获取四个标签,从而为用户留下更多的时间来记录更多位置。用户不必再在标签数量和位置之间进行权衡。

寻找正确的位置进行成像

在样本的正确位置上寻找和设置实验是具有挑战性的。实验人员需要使用目镜了解样本的整体概况,并记住不同的位置。数字显微镜可以生成样本的预览,这可以提供一些帮助,但实验人员仍然需要指出图像中要进一步成像的位置。MICA的Navigator工具可简化这一过程。用户可以生成低放大倍数或高放大倍数的预览,轻松定位感兴趣的区域,这些感兴趣区域可以用工具直接在图像上标记出。通过这种方式,后续高分辨率的图像可以保存下来。

选择正确的活细胞成像物镜

由于活细胞成像通常是在水溶液中进行的,高倍率物镜使用水作为浸没介质,因为它与培养基介质的光学特性相匹配。将水放在物镜和样品之间是很麻烦的,而且会导致样本的焦点和位置的改变。此外,水蒸发得相当快,因此需要不断补充。MICA集反馈回路于一体,在水浸式物镜的整个使用过程中,首先建立并维持浸没状态。这种方法不需要手动操作,可以进行长期实验。

为进一步提高光学质量,一些物镜会通过校正环来补偿样本平板的厚度。校正环可手动、也可自动操作。MICA配置了自动校正环功能,可实现自动优化。

重复实验之间的可比性

科学实验的一个关键方面是,尽可能少的变更可变参数以实现对样品和结果影响的把控。这包括在所有的实验中应用同一套成像条件。一个方面是稳定的环境条件(温度、pH值和O2,也见上文)。另一个重要方面是相同的成像参数(激发和检测)。MICA默认在不同项目中保持成像参数不变,用户仅基于自己的需求进行调整。可根据参考图像恢复成像参数。在环境条件方面,MICA是一个培养箱。MICA条件稳定能允许MDCK囊肿连续生长3周(也见下文)。

方法

Mica有用于活细胞成像的特殊的样本架。这包括用于小型(36毫米)和中型(60毫米)培养皿的支架。



图2:活细胞成像样本架。有适用于不同尺寸的培养皿的支架。活细胞成像也可以使用经典的载玻片支架(未显示),例如,使用ibidi µ-Slide 8 Well载玻片支架。

囊泡:

U2OS细胞同时用WGA-Alexa488和WGA-Alexa555进行染色。这两种染料都聚集在细胞的质膜和所有囊泡和内体上。荧光剂同时或序列成像以进行比较。环境被设定为37℃恒温和5%CO2,即生理pH水平。

对于高倍率成像,使用了带有自动加水功能的63x/1.20水镜。不需要人工操作。

斑马鱼:

图像中的鱼(斑马鱼)是一个带有中胚层命运报告基因的转基因鱼(Tbxta:GFP)。在这个实验中,一个发育中的胚胎从球期到体期被成像。用Dextran-Alexa647标记间质。胚胎保持在28℃。

囊肿:

a)将稳定转染了EB1-GFP的MDCK细胞在基质Matrigel中培养,在ibidi µ-Slide 8 Well玻片上诱导囊肿生长。环境被设定为保持恒定的37℃,5%的二氧化碳和高湿度。

在第2天,细胞已经显示出三维聚团,并在基质Matrigel内高度流动。

在第9天,囊肿保持相对稳定的位置,用较高的放大率(63倍)进行成像并在稳定状态下和随着时间的推移(6天和6小时的时间间隔的GFP和IMC(明场成像的调制对比))。三维采集能获得囊肿的三维图像(418层,220.7纳米间距,总Z-Stack大小92.02微米)。在第9天,一些囊肿除了EB1-GFP之外,还被Mito-Blue、SiR-Actin和Tubulin-SPY555标记。

b)5000个稳定地转染了EB1-GFP的MDCK细胞在U型孔板中生长。有趣的是,这些细胞在几天后也形成了囊状结构。其中一个囊状结构在共聚焦模式下被进一步研究,以进行三维重建。

结果
短期快速事件实验

U2OS细胞用两种不同的荧光染料标记相同的结构,WGA-Alexa488和WGA-Alexa555,它们都与细胞膜结合。通过在MICA序列模式下获取两个通道的这个实验设置能够在获取WGA-Alexa488(绿色)和WGA-Alexa555(红色)之间引入一个人为的时间差。有了这种实验设置,两种不同的Alexa染料标记同样的膜结构,能够在最小时间差的两个时间点成像。你可以在两种方法的比较中看到,在同步扫描中所有的囊泡都是黄色的——即绿色和红色的混合物,而在序列扫描中一些快速移动的囊泡看起来是两种不同的结构——即一个绿色和一个红色的囊泡。

视频 1:用WGA-Alexa488(绿色)、WGA-Alexa555(红色)标记的U2OS细胞。荧光通道是按序列成像的。你可以看到时空错配,这可以通过来自同一结构的绿色和红色信号来识别。比例尺 = 5 µm。

视频 2:用WGA-Alexa488(绿色)、WGA-Alexa555(红色)标记的U2OS细胞。荧光通道是同时成像的。比例尺 = 5 µm。

中期实验

斑马鱼是一种模式生物,经常用于发育研究。在这个例子中,我们感兴趣的是研究细胞在空间的协调性,而这种协调性受到周围组织的粘度的影响。在THUNDER模式下对两个通道进行了24小时的成像,并使用大容量成像解析(LVCC)以获得更多的细节。

视频 3:表达中胚层命运报告基因的发育中的斑马鱼胚胎(Tbxta:GFP;绿色)。间质液用Dextran-Alexa647(红色)标记。在超过24小时的延时拍摄中,用10x/0.32物镜采集了25个z-层和250微米厚度的z-堆栈,时间间隔为15分钟。使用了THUNDER 大容量成像解析(LVCC)。由Camilla Autorino提供,Petridou Group, EMBL Heidelberg(德国)。


长期实验

MDCK细胞是极化的上皮细胞,如果在Matrigel这样的基质上培养,会成熟为所谓的囊肿。这些三维结构可用于研究发育过程和潜在的蛋白质运输机制。这里,细胞被稳定地转染了与GFP相连的微管结合蛋白,并在MICA中培养了3周。
 


图3:MDCK囊肿。3周的活细胞实验的提取物。时间间隔为6小时。扩展景深(EDOF)。上图:通道叠加。中图:EB1-GFP。下图:宽场。THUNDER大容量成像解析(LVCC)。比例尺为20μm。图片由德国马尔堡菲利普斯大学的Ralf Jacob和Manuel Müller教授提供。

发育9天后,用活细胞染料对上述一些囊肿进行了染色,以观察肌动蛋白、微管蛋白和线粒体,此外还有GFP标记的微管结合蛋白。随后,在共聚焦模式下对囊肿进行了成像。

图4:第9天的MDCK囊肿(CLSM)。除EB1-GFP(绿色)外,部分囊肿用Mitto - blue(品红色)、SiR-Actin(红色)和Tubulin-SPY555(黄色)染色,并用63x/1.20物镜在共聚焦模式下成像。比例尺 = 20 µm。图片由德国马尔堡菲利普斯大学的Ralf Jacob和Manuel Müller教授提供。

在U型孔板中培养细胞也可形成囊状结构。本实验中,MDCK细胞从第1天开始在MICA上培养并在明场和宽场荧光模式下记录,以研究囊肿的形成。MICA培养箱的特性使细胞在发展成囊状结构的过程中保持良好的状态。

视频 4:用10x/0.32物镜、在GFP和明场通道下每隔30分钟对囊肿形成进行了三天的成像。比例尺 = 200 µm。

培养14天后,在低倍镜共聚焦模式对囊肿进行成像,以确定一个感兴趣的囊肿。96孔板的情况下筛选样本以寻找合适位置来做进一步研究可能是很麻烦的。Navigator工具在此帮助保持样本的预览,并轻松地导航到相关的感兴趣的区域。

 

图5:用10x/0.32物镜和GFP通道对第14天的囊肿进行预览(CLSM)。

然后用63x物镜在LIGHTNING共聚焦模式下对其中一个囊肿进行了更细节的成像。63x/1.20水镜的加水是自动建立,并通过自动校正环对样品进行了优化。视频5显示了在共聚焦模式下获得的卷积和用LIGHTNING处理的卷积的对比。

视频 5:用63x/1.20水镜在共聚焦模式下(左)用LIGHTNING(右)拍摄的单个第14天的囊肿(CLSM)。采集了285个Z-层, 57µm厚度的Z-层,并进行了三维重构。


结论

MICA高度适用于快速、短期到几周的长期活细胞成像实验,帮助用户获得可靠的结果。集成的培养系统在温度和pH值方面提供了接近生理的条件,使活细胞成像可以持续数周。另外,可以控制氧气水平,以获得更高的重要数据。FluoSync™技术可以同时对多达四个荧光团进行成像,这意味着可以对快速发生的细胞事件进行绝对的时空相关性成像。此外,FluoSync™缩短了记录多色图像之间的间隔,从而提高了时间分辨率。THUNDER和LIGHTNING帮助用户从样本中提取更多的细节,借助OneTouch的照明和自动浸水的自动化流程,即使是仅接受少量培训和有限技术背景的人员都可以轻松使用。

了解更多:
徕卡显微

参考资料

 


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