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使用显微镜观察和判读H&E染色
分辨组织样本的结构，了解显微镜在病理学应用中的多种功能
谈到显微镜在病理学家日常工作中的用处时，我们通常会想到诊断。除了病理学实验室工作流的这一阶段，显微镜在更早期的阶段也发挥着重要作用。实验室技术员或病理学家使用显微镜检查样本染色情况。
如果样本不经染色处理，在显微镜下只能看到组织切片或涂片标本的基本结构，但却无法看到进一步的细节。对于对比度不足的非常薄的切片尤其如此，有时几乎是半透明状态。
图1：图像中所示为未染色的组织切片。没有苏木精和伊红等染色，几乎无法识别不同的细胞类型或组织结构，也就很难从图像中获取有用信息，甚至无法进行有效的诊断。
经染色处理后，样本的不同部分显示为不同的颜色和染色强度，从而使组织内的结构可见。最常见的染色组合是苏木精和伊红，简称为H&E染色。
图2：载玻片浸入不同的溶液中进行染色。
H&E染色的原理
H&E染色前，首先要对组织进行固定、脱水、包埋和切片处理，然后将切片贴到载玻片上。染色前，一般需要使用二甲苯等溶剂移除包埋介质，通常为固体石蜡。然后将切片通过分级醇溶液，降低浓度并置于水中对切片补水。
在下一步中，将切片浸入苏木精溶液中，对细胞核进行染色。染色的强度取决于组织类型、切片厚度、浸泡时间等因素。观察玻片的病理学家的偏好也有影响。用水冲洗后，用蓝色染色液将苏木精的红染色变为蓝色。
图3：图中显示了40倍放大倍率下十二指肠内的细胞核。它们使用苏木精染为蓝色。尽管组织内的细胞很密集，伊红产生的淡粉色染色依然能够显示组织内的皱褶和其它结构。
检查强度和背景染色
在显微镜下快速观察后，实验室技术员或病理学家便可判断染色是否充分或过度。如果染色不充分，便需要在苏木精中再次浸染。如果染色浓度过强，切片显示背景染色，他们会使用酸性溶液淡化染色，实现切片染色的差异化。这一步骤后，需要再次使用蓝色染液并在自来水下冲洗。
下一步是伊红染色。伊红是苏木精的复染剂，可差异化地染出红细胞、胶原，并通过粉色展现出平滑肌。分化同样需要根据组织的情况用水洗去过量的伊红。然后将染色后的玻片浸入梯度乙醇中，再浸入二甲苯，对玻片脱水。完成染色和脱水后，使用封片剂来封装切片。
何时检查染色
究竟是在苏木精染色后在显微镜下检查染色和分化，还是在伊红染色后，不同的方案做法也不同。在苏木精染色后检查，无论是再次浸染还是重复分化，都方便立即调整。在伊红染色后检查，可以让实验室技术员或病理学家对全染色玻片有一个更好的了解。
快速检查在实验室工作流中具有重要的作用，可以确保负责诊断的病理学家看到需要的细节信息。
可见结构
使用明场照明可以观察H&E染色玻片。苏木精将细胞核染为蓝紫色，伊红将细胞质和结缔组织染为浅粉色。借助染色，病理学家可以轻松辨别不同的组织类型，例如肌肉或结缔组织，并发现切片中的畸形或不规则情况。这可以帮助它们识别反应特定的病理的变化，例如感染、慢性炎症或恶性肿瘤。借助可见信息，病理学家可以观察到组织内的结构变化，从而确定疾病的性质和进展。
图4：5倍放大倍率下的总览图显示了十二指肠中的三层组织：浆膜、粘膜下层和粘膜区域。每个区域对苏木精和伊红会有不同的反应，因此借助染料可以轻松辨别边界层。为识别潜在病灶，关键是要准确确定发生病理变化的确切组织部位和细胞类型。
图5：40倍放大倍率下的十二指肠显示了粘膜下层和粘膜区域之间的边界。通过H&E染色，可以轻松辨别不同的细胞类型。一种细胞突破两个组织隔室之间的天然障碍，通常为癌症进展的一种常见指示。
颜色差异
染色工作流和诊断中使用的显微镜需要可以很好的辨别颜色差异，这对及时、准确的诊断至关重要。检查染色时，通常使用小尺寸的独立正置显微镜，因为实验室工作台一般都比较拥挤。
诊断使用的显微镜则应配置性能优异的相机，以便拍摄到报告和归档所需的细微的颜色差异。注释功能也有助于创建报告。如果您想了解更多关于适当临床显微镜的信息，可以阅读文章“如何选择临床显微镜”。
推荐阅读：
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· M. Barszczewski, P. Zorzi, P. Laskey, C. Müller, Clinical Microscopy: Considerations on Camera Selection, Science Lab (2022) Leica Microsystems
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