关注公众号

关注公众号

手机扫码查看

手机查看

Ramina 应用实例|实时监测细胞培养性能测试

1.JPG

前言

拉曼光谱在复杂水体系中反映组分微小变化的能力深化了该技术在生物制药过程分析(如生物反应器中的细胞生长)方面的应用。拉曼光谱仪技术可以实时、原位和无损地监测生物制药生产过程,可用于复杂化学体系的连续过程监测拉曼光谱技术在生物反应过程中可检测大量代谢物变化的能力已将该技术提升为强大的过程分析工具


实验概述

拉曼光谱分析光学探头具有可重复使用的特点,通过减少运行间的可变性来提高过程监测的可重复性和可靠性。Thermo Scientific™ Ramina™ 过程分析仪可匹配多个光纤探头MarqMetrix 生物反应器球形探头是专为满足生物工艺工业的要求而设计的,可以搭载到 Ramina 过程分析仪上使用。这些探头具有快速、易于更换和连接以及耐用等特点,可以进行无菌处理,比如离线的高压灭菌。


image.png

DynaDrive 一次性生物反应器(S.U.B.)是 S.U.B. 技术的最新产品,为大规模生物生产提供了更好的性能,并具备可扩展性。与传统的 S.U.B. 设计相比,长方体的罐体具有几个关键优势,包括优越的混合和传质能力以及更好的可扩展性。


本应用介绍了Ramina过程分析仪系统与 500L HyPerforma DynaDrive 生物反应器的集成,并实现关键过程参数(CPPs)的在线测量,通过采集整个细胞生长培养过程中连续生成的光谱数据建立起若干参数和代谢物的精确预测模型。


材料与方法

细胞培养和喂养策略


细胞培养在500L HyPerforma DynaDrive S.U.B 中进行(见下图1),其中包含体积约为320L细胞培养基,在36.5℃,pH=6.9+/-0.3, DO=50%的条件下接种0.5x106个细胞/mL。体系的 pH 值通过添加二氧化碳气体和碳酸钠来控制。



细胞在化学定义的培养基中生长,从第3天开始每天进行两步喂养过程。第一种喂养介质以起始体积的重量为4%添加,第二种喂养介质以0.4%添加。第6天体系温度转为33°C。试验在14天后终止。生物反应器避光处理以防止杂散光干扰。在高压灭菌后,将 Ramina 过程分析仪生物反应器球形探头插入HyPerforma DynaDrive S.U.B. 中,进行在线实时拉曼光谱数据采集。



image.png

Ramina 过程分析仪测试

使用 Ramina 过程分析仪进行数据采集(见下图2), Ramina 过程分析仪的生物反应器球形探头直接浸入在生物反应器(500L) 中,每平均20次测量获取一张拉曼光谱数据,积分/曝光时间为3秒,激光功率设置为450mW。每个数据光谱的总采集时间为2分钟,在 Ramina 过程分析仪用以建立模型数据与离线仪器分析通过匹配时间戳以确认。


image.png

化学计量学模型建立


来自多台 Ramina 过程分析仪、探头和生物反应器的数据被用于创建模型。训练数据集从每个生物反应器的45个样本中收集,以创建每个化学计量学模型。对光谱数据进行了检查,剔除了由宇宙射线引起的异常谱峰。选择感兴趣的光谱区域,并对光谱进行预处理,以去除基线干扰并优化信噪比。


建模过程中测试了许多预处理技术,包括Savitzky Golay滤波、自动Whitaker平滑、多元散射校正、SNV和均值中心化。根据建模的关注点选择优化不同的预处理技术。为每个感兴趣的组分创立偏最小二乘(PLS)模型并进行交叉验证以测试每个模型的优化的效果。这些组分包括葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、TCD、VCD和其他在生物反应器培养过程中产生的常见代谢物。


结果

在这项工作中,在线拉曼光谱仪应用于连续分批补料 CHO 细胞培养过程。使用拉曼光谱监测工艺参数首先需要使用外部校准数据集(独立离线数据)建立化学计量学模型,通过对感兴趣的参数的离线分析数据和对应的在线拉曼光谱数据的关联关系建立模型。

image.png


为了评估 Ramina 过程分析仪预测值的准确性,每天收集生物反应器数据并进行分析比较。计算每个参数(RMSEP)的校准均方根误差(RMSEC)、交叉验证均方根误差 (RMSECV)和预测均方根误差。根据模型的预测计算平均误差,得到用于构建模型的 RMSECV。用模型未见过的“新”数据来测试模型,依据参数RMSEP判断。为每个 PLS 模型记录变异系数 R²。该值用于确定模型预测变量(X 变量)可以解释的 Y 变量的变化量。


值得一提的是,结合使用来自同一 CHO 培养过程的生物反应器运行的几个大型独立数据集,可以产生更准确和稳健的预测化学计量学模型。在这项研究中,来自之前生物反应器运行的五个独立数据集被组合起来训练一个大型化学计量学模型。然后将校准模型应用于此次 Hyperforma DynaDrive S.U. B 生物反应器的预测。数据表明该模型能够准确预测这个新数据集,并且模型预测与离线收集的众多代谢物的数据测量高度相关如下表1所示。


image.png


下图为赛默飞Hyperforma DynaDrive S.U.B.化学计量学模型预测——各重要参数的拉曼预测模型和离线数据对比。


image.png

image.png

image.png

image.png

image.png

结论

可重复使用MarqMetrix生物反应器BallProbe 探头具有TouchRaman浸没技术,连接Ramina过程分析仪,可对500L HyPerforma DynaDrive S.U.B.中的关键过程参数葡萄糖、谷氨酰胺和乳酸以及总细胞密度和活细胞密度进行准确的在线实时预测。相关性分析显示模型预测数据与离线分析数据之间具有良好的一致性,表明模型能稳健地应用于上表1中所示参数的预测。


互动福利

image.png

赛默飞世尔科技简介

赛默飞世尔科技是赋能科技进步的全球领导者。公司年销售额约400亿美元。

我们的使命是帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。我们帮助客户加速生命科学领域的研究、解决在分析领域所遇到的复杂问题与挑战、提高实验室生产力、通过提供诊断以及研发制造各类突破性的治疗方法,从而改善患者的健康。

我们全球的员工将借助于一系列行业领先的品牌——Thermo ScientificApplied BiosystemsInvitrogenFisher ScientificUnity Lab ServicesPatheonPPD,为客户提供领先的创新技术、便捷采购方案和全方位的制药服务。欲了解更多信息,请浏览公司网站:www.thermofisher.com

 

赛默飞世尔科技中国简介

1982年在中国设立第一个销售办事处至今,赛默飞世尔科技已正式进入中国40年。我们在中国的总部设于上海,并在北京、广州、香港、成都、沈阳、西安、南京、武汉、济南等地设立了分公司,员工人数超过7000名。我们的产品主要包括分析仪器、实验室设备、试剂、耗材和软件等,提供实验室综合解决方案,为各行各业的客户服务。

为了满足中国市场的需求,现有9家工厂分别在上海、北京、苏州和广州等地运营。我们在全国还设立了5个应用开发中心以及示范实验室,将世界级的前沿技术和产品带给中国客户,并提供应用开发与培训等多项服务;位于上海和苏州的3个中国创新研发中心,拥有110多位专业研究人员和工程师及100多项专利。创新中心专注于垂直市场的产品研究和开发,结合中国市场的需求和国内外先进技术,研发适合中国用户的技术和产品;我们拥有遍布全国的维修服务网点和特别成立的中国技术培训团队,在全国有超过2800名专业人员直接为客户提供服务。

我们致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。欲了解更多信息,请登录网站:www.thermofisher.cn



阅读原文
推荐
关闭