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前沿合作 | 基于岛津MALDI-TOF技术平台检测7种人冠状病毒及新型冠状病毒分型与重要突变位点的方法研究
SARS-CoV-2变异株的出现，使全球面临第二波冠状病毒疾病大流行的危机
目前，已知可以感染人的冠状病毒共有7种，分别为20世纪60年代发现的人冠状病毒HCoV-229E和HCoV-OC43，2003年新出现的SARS冠状病毒SARS-CoV，2004年发现的人冠状病毒HCoV-NL63，2005年新发现的人冠状病毒HCoV-HKU1，2012年7月在中东地区出现的MERS冠状病毒MERS-CoV以及2019年12月下旬爆发的严重性呼吸系统综合征冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。其中，2019冠状病毒病（Coronavirus disease 2019，COVID-19）引起了全球持续地大流行。尽管全球采取了许多干预和控制措施，截至2022年1月4日，已有200多个国家受到该病毒的影响，实验室确诊的COVID-19病例人数已超过2.9亿，死亡人数超过540万。
本次研究基于岛津AXIMA Performance MALDI-TOF质谱检测平台，旨在提供一种特异性强、灵敏度高的用于检测7种人冠状病毒（人冠状病毒229E、NL63、HKU1、OC43、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2），及新型冠状病毒（SARS-CoV-2）分子分型与重要变异株的检测方法。
岛津应对策略及解决方案
通过合理选择设计位点、适当添加修饰碱基，可以将延伸探针的质量加以区分，均匀分布于检测范围之内，从而达到多重检测的目的。整个检测反应流程分为五步（图1）：
图1 岛津AXIMA Performance MALDI-TOF用于7种人冠状病毒及新型冠状病毒分型与重要突变位点的检测流程示意图
第一步是一步法多重PCR反应，根据待检测位点两端的侧翼序列来设计引物与探针，在一个反应体系中实现逆转录PCR与多重PCR扩增反应，从而达到扩增待测位点的目的。第二步应用虾碱性磷酸酶（Shrimp alkaline phosphatase，SAP）对上一步PCR的反应产物进行处理，消化掉剩余的脱氧核酸核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）。第三步是单碱基延伸反应。事先针对每个检测位点设计一条短探针，探针可以结合到第一步PCR的扩增子上，同时令探针结合之后，延伸的第一个碱基就是要检测的多态性位点。向第二步的产物中加入这些探针，使用经修饰的双脱氧三磷酸核苷（ddNTP）作为反应底物，再配合专用的扩增酶进行反应。第四步是树脂纯化。第五步是质谱检测。将第四步的反应产物转移到包被基质的点样靶板上，待样本结晶之后，使用飞行时间质谱仪检测延伸的单碱基质量大小，来判定检测靶基因的有无，从而进一步判定样本中目标病原体的有无。
本方法经特异度评估、灵敏度评估以及稳定性评估，结果如下：
l 使用28种常见呼吸道病原进行本方法特异度检测，测试结果显示，该方法与常见呼吸道病原均无交叉反应，说明该方法具有良好的特异度；
l 梯度稀释核酸样本，测试本方法的灵敏度，测试结果显示本方法检出限为250copies/mL；
l 使用多个样本检测本方法的稳定性，检测结果显示，不同检测样本的检测结果一致，该方法表现出良好的稳定性。
方法 · 特点
创新性地使用一步法多重PCR技术与核酸质谱检测分析方法联用，实现从临床样本核酸提取后直接进行检测和分型，不需要额外进行RNA的逆转录，很大程度上缩短检测时间和减小试剂的消耗；
与高通量测序技术相比，该方法一次性可处理和分析96或384份样本，且可在一天内获得7种人冠状病毒的检测结果，及SARS-CoV-2基因组中重要的突变信息，并对其进行分型，特别适用于大规模的流行病学研究和重要型别的监测；
该方法具有灵活易用的特点，随着SARS-CoV-2病毒的不断地进化和基因组新突变的产生，新出现的重要突变位点可以被纳入用来设计更全面的检测方法。
结论
岛津中国创新中心与中国医学科学院病原生物学研究所合作开发了一种基于MALDI—TOF平台检测7种人冠状病毒及新型冠状病毒分型与重要突变位点的检测方法。利用一步法多重PCR与MOLDI-TOF质谱技术联用来鉴定7种人冠状病毒与新型冠状病毒的重要突变位点。我们通过对包含新型冠状病毒在内的7种人冠状病毒的每一种目标病原体，选择种间特异且种内保守的基因作为检测靶基因，同时根据GISAID公布的用于新型冠状病毒分型与重要突变位点检测的重要突变位点作为靶点。针对上述检测靶点，设计相应检测试剂，旨在开发和评估一种可直接用于7种人冠状病毒检测和新型冠状病毒分型的快速、简便、无须测序的方法。该方法的建立为动态监测SARS-CoV-2病毒的感染和主要型别的全球流行情况提供强有力的手段。
*文中推荐技术方法方案仅用于医学及科研人员技术交流，不作为临床诊断依据。
*本研究的相关成果已申请国家专利（申请号：202111084113.0）。
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