工程细胞株开发系列之表达系统对比

丹纳赫生命科学

2022.1.20

细胞株开发是抗体药物CMC的起点和基础，细胞株的好坏直接决定生产成本、工艺复杂度和产品质量。一个好的细胞株有多方面要求：

1.产量高：可降低固定投资和单次生产成本。

2.产品质量符合要求：产品质量影响药效和安全性，而这两项是IND和NDA的关键。

3.稳定性高：产量和质量在生产传代过程中不应有大的改变。

4.可放大性：细胞株需要适合大规模生产放大。

5.合规性：保证单克隆源性以及实验记录完整性。细胞株的构建过程应避免接触或使用动物来源成分或其它可能影响安全性的成分。

工程细胞株开发第一步就是需要考虑采用何种表达体系。宿主细胞系直接影响产品的特定属性，比如糖基化、羧基化、羟基化、酰胺化等；甚至还可能影响半衰期、免疫原性和生物学活性。宿主细胞系应完整表征，有着完整的记录，不含TSE/BSE等病毒污染因素。宿主细胞应适合无血清培养基，或者无动物来源成分的培养基中悬浮生长。

表达体系的区别

微生物表达系统

Part 1

早期生物药以微生物表达系统为主，因为哺乳动物细胞培养基成本高、产量低，需要加入血清，存在安全隐患。微生物生产系统主要包含：大肠杆菌、酵母、假单胞菌和芽孢杆菌。大肠杆菌系统研究较早，机制了解透彻，不存在动物来源污染的风险。大肠杆菌生长速率高，倍增时间仅为20-30分钟，营养要求简单，因此生产成本很低。可用于胞内表达或分泌表达，胞内表达既可以是可溶性蛋白，也可以是以包涵体形式存在的不可溶蛋白。但是大肠杆菌最大的劣势就是翻译后修饰不足和大分子蛋白表达困难。

酵母表达系统优势：生长速度快，培养成本低，可以表达分泌性产品。酵母为真核表达，因此正确折叠蛋白能力与翻译后修饰（信号肽切割，二硫键形成，亚基组装，乙酰化和糖基化等）都是比大肠杆菌更好。但是酵母不含有哺乳动物的伴侣蛋白，因此需要进行人源基因改造后才能表达人类蛋白。

目前市场上微生物系统表达的产品有：人胰岛素，人血白蛋白，肝炎疫苗，HBV，微纤溶酶，单抗片段等。如下图所示，截至2014年，微生物表达系统在欧洲市场与美国市场依然占据49%的市场份额。

哺乳动物细胞表达系

Part 2

哺乳动物细胞表达体系又可以细分为人源细胞和非人源细胞。哺乳动物细胞具有和人类相似的复杂翻译后修饰，常被用来表达具有活性的生物大分子蛋白。而这些生物大分子的功能发挥在一定程度上依赖于这些翻译后修饰。在1984-2004年，哺乳动物细胞培养的密度增加了5倍，培养时间延长3倍，批次发酵工艺产量从100mg/L左右提高到>15g/L，采用灌流培养工艺甚至可以达到80g/L。因此在人源蛋白生产中，哺乳动物细胞培养工艺渐渐取代了微生物发酵工艺。

第一个人源细胞系是1951年建立的HeLa细胞系。在1960s，人二倍体细胞被用于疫苗生产。但人们对致癌病毒的担心使人源细胞能用于商业化生产的种类较少，上市产品只有人胚胎肾细胞（HEK293）,纤维肉瘤细胞（HT-1080）和Namalwa淋巴瘤细胞。人源细胞表达系统最大的优势就是翻译后修饰。

非人源哺乳动物表达系统主要包括CHO细胞，杂交瘤细胞，BHK细胞，Vero细胞和MDCK细胞。杂交瘤和BHK细胞主要用于重组蛋白生产，Vero和MDCK细胞主要用于疫苗的生产。CHO细胞在生物药生产中占据主导地位，在2015年后获批的药物中，CHO细胞表达体系占据超过一半的比例。这主要是因为CHO细胞在生物药生产中应用早、表达量高、容易处理和操作，法规接受程度高。致病性的病毒在CHO细胞中无法复制，因此CHO细胞被认为是非常安全的表达体系。CHO细胞具有较高的基因和表型不稳定性，因此有较多的细胞谱系，例如DG44、DXB11、CHO K1、CHO-S等。

工业上使用较早的是DHFR体系（二氢叶酸还原酶缺陷型）DG44细胞。当细胞培养基内还有MTX（甲氨蝶呤）时，二氢叶酸还原酶被抑制，通过反馈调节，使得该基因自我扩增，连带其上下100-1000kb的基因都会扩增，因此目的基因也得到扩增，即可以提高目的蛋白的表达量。

GS体系（谷氨酰胺合成酶）CHO-K1较DHFR系统有明显的优越性。其原理是GS在ATP水解提供能量的同时，利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺。在谷氨酰胺缺失的培养基中加入GS抑制剂甲硫氨酸亚砜亚铵（MSX），可使GS基因及与之相连的目的基因得到有效扩增，从而达到提高目的基因表达水平的目的。该系统的优点：不需要基因缺陷型的CHO-K1细胞株做为宿主细胞；CHO-K1细胞易于培养；培养基中无需加谷氨酰胺，避免其降解产生大量铵离子，降低了工艺控制的难度，并且可有效提高细胞发酵密度和延长细胞生存时间。

除了上述两种代谢型筛选标记，哺乳动物细胞筛选还经常使用抗生素型筛选标记，最常用的是嘌呤霉素和G418，但是单独采用抗生素进行筛选的平台，因筛选效率较低，多用于研究阶段。总结如下：

昆虫细胞表达系统

Part 3

昆虫表达系统作为哺乳动物细胞表达系统的替代系统。最常见的昆虫细胞系为SF9, SF21和SF+等。昆虫表达系统可以用于早期研发，也可以用于工业化生产。在哺乳动物细胞表达量不高的时候，昆虫细胞可以快速提高表达量至克级，对于药物筛选或结构研究很有帮助。昆虫细胞一般采用病毒感染而不是质粒转染，昆虫表达系统存在两个问题导致其并未大规模商业化：1昆虫表达系统的糖基化修饰比微生物系统有很大的进步，但是和哺乳动物细胞依然有区别；2表达量达到一定水平后很难再进一步提升。

整个工程细胞株开发过程中，在做细胞培养、转染、筛选时，我们需要时刻关注细胞的活率和状态，但这样的工作人工操作时需要考验检测人员的眼力、耐心和专注力，有时会费时费力，而且可能会存在一定的人工误差。丹纳赫生命科学旗下贝克曼库尔特生命科学的Vi-CELL BLU 细胞计数器以及细胞活性分析仪可以全自动进行细胞活力分析与细胞计数，无需人员之手，帮助用户实现标准化的细胞计数和活力分析，是生物制药行业计数和活力测试的标准分析方法之一，其软件满足21 CFR part 11，符合审计追踪的要求。

另外，贝克曼库尔特生命科学近日推出的BioLector XT新一代高通量微型生物反应器，是帮助您进行细胞筛选的利器，它可加速对包括厌氧菌在内的多种生物的培养评估，始终如一地产生高质量数据。它体积小巧，支持以48孔微孔板形式对关键培养参数（包括生物量、pH、溶解氧和荧光信号）进行稳健、实时的评估。随着新产品的推出，微型生物反应器技术在自动化和高通量方面获得极大提升。其适用于细菌、真菌和藻类等的高通量菌株筛选、培养基优化和发酵参数开发等，能显著提高工作效率，获得真正高质量的菌株、培养基和发酵参数等，提高放大成功率，大幅降低实验成本，并增加新发现几率。

本文参考资料

1.Biopharmaceutical Processing: Development, Design, and Implementation of Manufacturing processes. Günter Jagschies, Eva Lindskog, Karol Łącki, Parrish Galliher. 2018

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