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如何在 PCR 检测过程中降低检测结果假阴性概率,默克 Milli-Q Q 博士带大家走入核酸检测的常用方法-PCR 方法

2020.6.05

刚刚结束的五一小长假,Q 博士见到越来越多的人出门踏青,这意味着国内疫情防控的常态化,人们对正常出街的安全性越来越有信心。然而不时发生的「假阴性」现象也仍然是科学家和普通群众愈发关心的关键问题。

今天 Q 博士带大家走入核酸检测的常用方法-PCR 方法,以及如何在 PCR 检测过程中降低检测结果假阴性概率。

1.  什么是 PCR 技术?

PCR 技术又称为聚合酶链式反应。是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊 DNA 复制,PCR 的最大特点是能将微量的 DNA 大幅增加。

在新冠病毒检测中,核酸检测被定义为临床诊断的金标准,RT-PCR 技术被反复提到,它是一种将 RNA 反转录与 PCR 相结合的技术。首先在反转录酶的作用下,将提取到的 RNA 合成 cDNA, 再以 cDNA 为模板,在 DNA 聚合酶作用下不断扩增(变性-退火-延伸多个循环)合成目的片段并进行分析。

 

2. PCR 用水

PCR 技术目前多搭配试剂盒使用,也有用户自行制备反应体系,无论哪个过程都需要使用水。无论是近年来季节性爆发的甲流乙流,还是目前全球都在经历的新冠病毒,在检测过程中都涉及一个痛点,那就是如何尽可能提高核酸检测的准确性,减少假阴性结果出现的可能性。

我们首先分析一下假阴性结果出现的可能性,以新冠病毒核酸检测为例,假阴性的主要原因有:

●  病人病程:不同病程,患者体内病毒载量不同

●  采样部位:咽拭子,鼻咽拭子,痰液,肺泡灌洗液等不同采样部位病毒载量均不同

●  采样准确性:拭子质量,工作人员操作等

●  试剂盒的质量:引物设计以及水质控制

为了顺利将提取到的 RNA 反转录并实现 DNA 的成功扩增,必须抑制核糖核酸酶(RNases)的降解作用,如果试剂盒用水内含 RNases,将极有可能导致假阴性结果的出现。

 

3.  去除 RNases 的主要方法

●  高压灭菌:即便是在 180℃ 下高压灭菌 4 h 之后,RNases 仍保持某些活性,且某些特定细菌失活会释放更多的 RNases

●  DEPC 法(二乙基焦碳酸酯处理法):利用二乙基焦碳酸酯(DEPC)处理方法使化学酶失活是用来抑制水溶液中 RNases 活性的常见方法。然而,二乙基焦碳酸酯是一种可疑致癌物,处理须小心;同时该方法虽然能够使酶永久失活,却无法将其从水中去除,同时清除多余的 DEPC 过程中,会产生乙醇,二氧化碳等其他污染物。

●  超滤法:超滤是一种真正能够从水溶液中清除 RNases 的方法。默克 Milli-Q 选用内置在丙.烯腈丁苯橡胶(ABS)外壳中的聚砜超过滤膜作为超滤柱的主要成分,在一定水流速一定浓度范围内,超滤具有充分的截留作用。超滤处理可有效取代 DEPC 处理方法生产无 RNase 水。

 

4. Milli-Q 生产无 RNases 水解决方案:

一个短视频告诉您TA 的黑科技默克 Milli-Q®第七代产品系列视频

默克 Milli-Q® Biopak 终端精制器

即使国内疫情已经基本控制,但 Q 博士提醒大家仍然要积极防护,保护自己。戴口罩,勤洗手。默克 Milli-Q®与您携手,早日结束这场攻坚战!


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