鼠脑胶质瘤蛋白质及代谢物的超高分辨MALDI质谱成像

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鼠脑胶质瘤蛋白质及代谢物的超高分辨MALDI质谱成像

2022.5.26

质谱成像技术被用于揭示胶质母细胞瘤组织切片的化学空间结构，并可直接进行组织分析定位神经胶质瘤及肿瘤恶性程度分级。

2017年4月，意大利比萨大学的M. Dilillo和荷兰莱顿大学医学中心L. A. McDonnell教授，在国际著名期刊Scientific Reports上发表了“Ultra-High Mass Resolution MALDI Imaging Mass Spectrometry of Proteins and Metabolites in a Mouse Model of Glioblastoma”的研究文章，使用超高分辨磁共振质谱和质谱成像方法对脑胶质瘤的蛋白标志物及代谢物定位和鉴定，这里为大家解读一下这项研究工作。

文章简介

《鼠脑胶质瘤蛋白质及代谢物的超高分辨MALDI质谱成像》

多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme, GBM）是恶性程度最高的神经系统肿瘤，具有较高的浸润性和异质性，临床预后差。MALDI质谱成像已被证实应用于生物医学研究领域，可以与组织学图像相结合，使形态学信息与病理组织分子信息联系起来，以确定与疾病、转移状态、患者预后和化疗反应有关的分子变化。

文章介绍了一种超高质量分辨率质谱MALDI-FTICR MSI（15T solariX XR）对小鼠胶质瘤模型中蛋白质成像的研究方法。通过布鲁克15T solariX XR和MALDI-TOF MSI（ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF）两种质谱仪分别对胶质瘤组织完整蛋白质进行成像，阐述了质量分辨率对检测结果的影响，进一步通过激光显微切割（Laser Capture Microdissection，LCM）技术，获取健康和肿瘤组织微区域，与LC-MS/MS的分析结果相比对，提高鉴定结果的可信度。

MALDI 成像方法

对于完整蛋白质的MALDI MSI，根据Enthaler方案清洗组织切片, 除去组织表面的盐和高含量的脂质, 使用芥子酸（SA）基质。对于代谢物成像，使用9-氨基吖啶（9-AA）基质，对于神经递质和氨基代谢物的成像，在经过2,4-二苯基吡喃铵四氟硼（DPP-TFB）衍生化后施加2,5-二羟基苯甲酸（DHB）基质。大分子蛋白质MALDI质谱成像在布鲁克15T solariX XR和ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF质谱仪上进行，正模式，125μm像素点，15T solariX XR在m/z 16000可达到同位素分辨率。小分子代谢物在9.4T solariX XR质谱仪上成像，正模式测定神经递质和氨基代谢物，负模式测定腺苷酸和TCA循环中间体。MALDI质谱成像后的组织切片样本用70%乙醇洗去基质后，用甲酚紫溶液染色，在玻片扫描仪上记录高清组织学图像。肿瘤和健康组织蛋白组学样本使用激光捕获显微切割LCM获得，收集在EP管中，用顺磁珠SP3方法制备蛋白组酶切样本。

质量分辨率对于分析病理组织中完整蛋白的重要性

对于完整蛋白，与MALDI-TOF MSI相比较，MALDI-FTICR MSI可以获取更丰富的谱图信息，它可以同时获取蛋白同位素的空间分布，而在MALDI-TOF成像谱图数据中只表现为一个宽峰，或检测不到，而这些蛋白可能分布在肿瘤区域，是肿瘤标志物或是一个新的靶点。在肿瘤和健康区域，分别通过MALDI-FTICR MSI采集数据，可以迅速获取蛋白的表达差异，而在整个组织切片的平均谱图中无法显示。还可以检测蛋白质不同存在形式和带电荷情况，如组蛋白的甲基化和乙酰化分别与组蛋白的不同存在形式和电荷状态有关，而相同蛋白不同电荷下的空间分布相同，鉴定结果也可以得到很好的内部验证。对于分子量相似的含同重素蛋白的分布也可以通过MALDI-FTICR MSI进行检测。

MALDI MSI与LCM-LC-MS/MS联用，提高可信度

组织切片在MALDI成像、LCM切割和蛋白提取酶切后，基于自下而上（Bottom-up）的方式，经LC-MS/MS进行对蛋白进行鉴定。从FTICR MSI采集的健康和肿瘤区域数据中提取出平均谱图。将FTICR MSI测定的蛋白质离子的精确质量和同位素分布与LC-MS/MS法测定的蛋白质的理论质量和同位素分布进行同区域间的比较。所有蛋白质离子的比对都基于较高的质量精度，<10ppm，以及实验和理论同位素分布之间的高相关性（在Matlab中执行，相关系数r≥0.95）。通过MALDI MSI检测的，同时考虑由于PTMs（单甲基化，二甲基化，三甲基化，组蛋白乙酰化），化学修饰（单和双氧化，二硫键和脱酰胺化），以及加合物（Na+，K+，基质加合物）可能导致的质量偏移。

MALDI-FTICR MSI数据与LCM-LC-MS/MS结果进行比对，分析结果的一致性突出了MALDI MSI研究中与癌症相关的其他蛋白质。鉴定了胸腺素β4（m/z 4964.3）和胸腺素β10（m/z 4937.3），胸腺素β4的表达被认为是抗胶质瘤治疗的一个新的分子靶点，而胸腺素β10参与了肿瘤细胞胃动素的调控，因此被认为与多种肿瘤的侵袭和转移有关。还鉴定了许多核糖体蛋白质，小亚基和大亚基（40s和60s）的核糖体蛋白质在许多不同的癌症中都有较高水平的表达，包括胶质瘤和其他脑肿瘤。

代谢研究的新思路

肿瘤细胞新陈代谢的变化是癌症的标志。基于LCM-LC-MS/MS蛋白质组学分析揭示了一些蛋白质参与代谢途径，表现出不同的表达水平。已鉴定的蛋白质的作用通过PANTHER分类系统追溯到特定的途径。这些蛋白质是参与谷氨酰胺合成过程和 TCA 循环的酶。

应用MALDI-FTICR MSI对代谢物进行成像，在正离子模式下检测神经递质和氨基代谢物，负离子模式下检测腺苷酸和TCA循环中间体。脑组织中肿瘤区域和健康区域的比较证实了涉及许多不同代谢途径的代谢物的差异调节，并与生物合成底物产量的增加促进增殖相一致。如通过MALDI-FTICR MSI检测到葡萄糖-6-磷酸/果糖-6-磷酸酯（结构异构，质量难以区分）信号的增加与糖酵解葡萄糖摄取量的增加一致。葡萄糖-6-磷酸可以转化为3-磷酸甘油酸，然后通过两个步骤转化为甘氨酸: 两者都在肿瘤中较高的水平被发现。

MALDI-FTICR MSI具有超高的分辨率和质量精度，而MALDI-TOF MSI具有更高的采集速度和质量范围。我们可以根据实际需求选择合适的仪器。

以上内容源自：

[1] Ultra-High Mass Resolution MALDI Imaging MassSpectrometry of Proteins and Metabolites in a Mouse Model of Glioblastoma,Scientific Reports. 2017, 7(1):603.

Doi: 10.1038/s41598-017-00703-w

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