赛默飞混合模式色谱柱方法开发指南 (Ⅰ)

赛默飞色谱与质谱分析

2022.8.03

在液相色谱分析中，反相色谱柱 (如Hypersil GOLD C18) 对强极性或可电离化合物的保留较弱，而离子交换色谱柱 (如Hypersil GOLD SAX) 则对疏水性强的化合物的保留不足。赛默飞科学家通过将离子交换与反相或亲水作用的官能团创新结合，在反复试验并不断优化后，赛默飞混合模式色谱柱应运而生。

与传统的反相、亲水作用和离子交换色谱柱的单一保留模式相比，赛默飞Acclaim系列混合模式色谱柱的创新型键合相，具有du特的表面化学结构，能够提供特殊的多重保留机制，最大限度的优化选择性。通过调节缓冲盐浓度、pH 值及有机相比例，在Acclaim系列混合模式色谱上，可实现同时保留强极性、中等级性和弱极性组分，也可以同时分离酸性、碱性和中性化合物。

认识赛默飞Acclaim系列

混合模式色谱柱

Acclaim Mixed-Mode 系列为双重混合模式 (Bi-modal)，Acclaim Trinity 系列为三重混合模式 (Tri-modal)，色谱柱混合机制如图1 所示。在美国药典(USP)色谱柱分类中，Acclaim Mixed-Mode WAX-1和WCX-1分别归属于L78和L85。

图 1 Acclaim Mixed-Mode 系列和Acclaim Trinity 系列色谱柱多重混合机制示意图（点击查看大图）

1.1 Acclaim Mixed-Mode 系列

Acclaim Mixed-Mode 系列混合模式色谱柱能够在单一键合相上提供多种保留机制，选择性与 C18 反相色谱柱互补。

Acclaim Mixed-Mode WAX-1键合相为带有叔胺末端的疏水烷基链键合硅胶，疏水烃链提供反相保留 (RP)，叔胺端基提供弱阴离子交换 (WAX)，适用于酸性化合物分析，如含羧酸、磺酸官能团结构，有机酸类。

Acclaim Mixed-Mode WCX-1键合相为带有羧基末端的疏水烷基链键合硅胶，疏水烃链提供反相保留 (RP)，羧基端基提供弱阳离子交换 (WCX)，适用于碱性化合物分析，如含伯仲叔胺及季铵结构，有机胺类、含氮杂环结构。

Acclaim Mixed-Mode HILIC-1键合相为带有二醇基末端的疏水烷基链键合硅胶，疏水烃链提供反相保留 (RP)，二醇基端基提供亲水作用 (HILIC)，适用于极性和非极性化合物的分离。

图 2 Acclaim Mixed-Mode 系列双重混合模式色谱柱键合相示意图（点击查看大图）

赛默飞小贴士

Acclaim Mixed-Mode WAX-1 / WCX-1 色谱柱必须始终使用含有缓冲盐的流动相进行活化、分析或保存；

Acclaim Mixed-Mode WCX-1 禁止使用醇类作为样品溶剂或流动相。

1.2 Acclaim Trinity 系列

Acclaim Trinity 系列混合模式色谱柱基于 Nanopolymer Silica Hybrid (NSH，纳米聚合物硅胶杂化) 技术，其设计旨在使方法开发能够取得最大的灵活性。全多孔裸硅胶通过共价修饰键合上具有双重混合模式的官能团，使得硅胶表面带上电荷，而带相反电荷的聚合物微球通过静电驱动自组装工艺与改性硅胶进行杂化，得到Acclaim Trinity三重混合模式。NSH技术可以确保内孔区和外表面具有明确的空间分隔，内外电荷属性相反，从而使其同时具有两种离子交换保留机制，并可独立控制。

Acclaim Trinity P1硅胶内孔区弱阴离子交换和反相保留 (WAX/RP)，聚合物外表面强阳离子交 (SCX)；Acclaim Trinity P2硅胶内孔区弱阳离子交换和亲水作用 (WCX/HILIC)，聚合物外表面强阴离子交换(SAX)；Acclaim Trinity Q1硅胶内孔区弱阴离子交换和反相保留 (WAX/RP)，聚合物外表面弱阳离子交换 (WCX)。

Acclaim Trinity 系列混合模式色谱柱适用于强极性化合物及离子的分析，Trinity P1与Trinity P2选择性互补，为活性药物成分与对离子分析提供全面的解决方案。

图 3 Acclaim Trinity 系列三重混合模式色谱柱键合相示意图（点击查看大图）

赛默飞小贴士

Acclaim Trinity P1 / P2 / Q1 色谱柱必须始终使用含有缓冲盐的流动相进行活化、分析或保存；

Acclaim Trinity P2 / Q1 禁止使用醇类作为样品溶剂或流动相；

在使用过程中应避免频繁大幅度的切换流速，否则会导致柱压激增，损伤柱床。

1.3 Acclaim系列混合模式色谱柱理化参数

表 1 Acclaim系列混合模式色谱柱理化参数

（点击查看大图）

赛默飞Acclaim系列

混合模式色谱柱典型应用

由于反相离子对色谱法，方法稳定性差，对色谱柱损伤大，且与质谱不兼容，在接下来探讨酸性碱性化合物分离保留时，该方法已被排除在外，不在讨论之列。

反相液相色谱法分离保留酸性化合物(有机酸)的机制，主要是通过低pH (pKa-2)、高比例水相流动相来实现。低pH可抑制酸性化合物电离，降低目标物极性，高比例水相可减弱流动相洗脱强度，增强反相保留，从而达到分离的目的。当方法转移至LC-MS/MS时，流动相会添加0.1%甲酸来增强反相保留，而酸性化合物采集模式为负模式，甲酸的引入势必会抑制负模式的响应。同理，反相液相色谱法分离保留碱性化合物(生物碱)时，通常会选择高pH (pKa+2) 流动相来增强反相保留。针对液质方法，流动相一般会添加0.2‰的氨水，同时也会抑制正模式的响应。

因此，液质方法在分析酸性或碱性化合物时，会出现保留与响应难以兼顾的情形，而液相方法在同时分析酸性和碱性化合物时，会显得捉襟见肘。另外，流动相较高或较低的pH，对反相色谱柱及液相系统的耐受性带来了新的考验。

采用Acclaim系列混合模式色谱柱分析酸性或碱性化合物时，可选择较为“温和”的流动相条件进行试验，如乙腈-25mM磷酸氢二铵(pH=5.0)或乙腈-50mM乙酸铵(pH=5.0)，配合调节缓冲盐浓度、pH 值、有机相比例及柱温，即可快速完成液相色谱条件的优化。目标物特征吸收接近紫外端，可选择磷酸缓冲盐；配合质量型检测器时，须选择挥发性缓冲盐；调节缓冲盐浓度及有机相比例时，应避免出现盐析。在整个方法开发过程中，无须使用离子对试剂，与质谱兼容性较高，可轻松实现方法转移，在食品极性农兽残分析及药物极性杂质谱研究中有着广泛的应用前景。

2.1 酸性/碱性化合物的分析