分享至
【应用案例】洋地黄毒苷分析方法转换，性能体验全面升级
七叶洋地黄双苷滴眼液为复方制剂，常用于治疗眼底黄斑变性等疾病，有效成分主要包括洋地黄毒苷及七叶亭苷，根据《中国药典》的要求，每支洋地黄毒苷的含量必须符合标准。但《中国药典》中介绍的使用内径4.6 mm、填充颗粒直径为5 μm的大尺寸色谱柱分析方法需要较长的分析时间，且流动相消耗量大。
那有没有办法改善这一情况呢？当然！
为了缩短运行时间，进而提高样品分析效率和减少溶剂消耗量，小编就为大家介绍一种方法，将原始HPLC方法转换至亚2 μm的UPLC色谱柱，使这些小粒径填料的色谱柱能够在保证同等分离效果的前提下大大缩短运行时间，降低成本。
在本实验中，小编成功地将分析洋地黄毒苷及其相关物质的HPLC方法分别转换至UPLC的三种不同颗粒平台，并筛选出最优的色谱柱，成功完成方法转换，提高分析效率。
应用优势
使用ACQUITY UPLC H-Class系统升级洋地黄毒苷及其相关物质的原HPLC分析方法
利用亚2 μm颗粒将分析速度提高4倍以上
使用沃特世三大UPLC色谱柱颗粒平台进行筛选
沃特世解决方案
ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱
沃特世PDA检测器
沃特世CSH C18 色谱柱
Empower 3 色谱数据软件
沃特世液相方法转换器
接下来，我们一起看看具体实验过程：
实验仪器
图1.ACQUITY UPLC H-Class系统
原HPLC实验条件
LC系统：Alliance e2695高效液相色谱系统，配PDA二极管阵列检测器
分析时间 ：50 min
色谱柱规格：C18， 4.6 mm x 250 mm，5 μm
柱温： 30 ˚C
检测波长：220 nm
进样体积： 100 μL
流动相： A：水 B：乙腈，梯度洗脱，梯度表如下：
时间(min)流速(mL/min)流动相A(%)流动相B(%)01.0851551.08515351.04060411.08515501.08515
现UPLC实验条件
LC系统：ACQUITY UPLC H-class超高效液相色谱系统，配PDA二极管阵列检测器
分析时间 ：11 min
色谱柱： ACQUITY UPLC CSH C18，2.1 mm x 100 mm，1.7 μm
柱温：30 ˚C
检测波长：220 nm
进样体积： 5 μL
流动相： A：水 B：乙腈，梯度洗脱
方法转换及沃特世方法转换器
将方法转换至粒径更小的色谱柱有助于缩短运行时间和加快线性速度，进而提高通量和分析效率，但这一过程的前提是必须保持原始方法的分离能力。为此，我们使用与原始方法中柱长(L)、粒径(dp)相同的色谱柱，适当地缩放流速、进样体积和梯度时间以保持分离完整性一致。
在不同LC系统之间转换色谱方法有一定难度，这些仪器的系统延迟体积通常有所差异，而这可能导致梯度方法的色谱分离效果较差或者峰畸变。因此，在不同LC系统之间转换梯度方法时，必须考虑系统延迟体积的差异。
使用沃特世Empower 3软件的液相方法转换器，可以将洋地黄毒苷及其相关物质的HPLC分析方法简便而快速地转换为UPLC方法。对流速、进样体积和梯度时间进行几何缩放，完美地保持分离的完整性。
具体使用方法如下
在左侧输入原HPLC色谱柱和系统延迟体积及流动相梯度表等，在右侧输入UPLC色谱柱等相关参数，软件即可自动计算出柱体积等参数，并转化成相应的UPLC梯度表，得出进样前开始梯度的体积及进样体积等参数。如下图所示：
图2. 沃特世 Empower 3软件的液相方法转换器示意图
转换后UPLC方法的Pre-injection体积为317 μL，检测梯度表如下：
时间(min)流速(mL/min)流动相A(%)流动相B(%)00.485151.040.485157.290.440608.540.4851510.420.48515实验过程及结果
原HPLC方法的色谱图
图3.原HPLC方法的洋地黄毒苷及其相关物质的色谱图
注：根据中国药典方法关于洋地黄毒苷含量测定的要求，需要量取相对洋地黄毒苷峰的比保留时间为0.4-0.99之间的各主要色谱峰的面积及洋地黄毒苷峰的面积，通过公式计算出洋地黄毒苷的含量。因此，HPLC和UPLC方法里，我们只关注相对洋地黄毒苷峰的比保留时间为0.4-0.99之间的各主要色谱峰和洋地黄毒苷峰
为了实现方法转换，同时保持与原始HPLC方法的同样分离能力，色谱柱的选择尤为重要。因此，我们在沃特世三大UPLC色谱柱平台BEH C18（亚乙基桥杂化颗粒），CSH C18（表面带电杂化颗粒）以及HSS C18（高强度硅胶颗粒）中进行筛选，具体色谱柱的型号及规格如下：
UPLC BEH C18，2.1×100 mm，1.7 μm
UPLC HSS C18，2.1×100 mm，1.8 μm
UPLC HSS T3，2.1×100 mm，1.8 μm
UPLC CSH C18，2.1×100 mm，1.7 μm
通过考察四款UPLC色谱柱，并综合评估色谱峰的峰形、数目等因素后，最终发现UPLC CSH C18 色谱柱分离的色谱图与原有谱图最接近，相应的色谱图及重现性结果如下：
图4. UPLC CSH C18色谱柱分离洋地黄毒苷及其相关物质的色谱图
图5. UPLC CSH C18色谱柱分离
洋地黄毒苷及其相关物质的8针重现色谱图
实验结论
使用沃特世Empower 3软件的液相方法转换器，结合ACQUITY UPLC H-Class/PDA系统及亚二微米色谱柱，将洋地黄毒苷及其相关物质的HPLC分析方法成功转换为UPLC方法。
方法转移过程中，色谱柱的选择尤为重要，沃特世具有广泛而多样的色谱柱平台，为方法转移/转换提供了便利条件，方便大家进行色谱柱筛选。
新的UPLC分析时间从原来的50 min缩短到11 min，效率提升4.5倍，溶剂消耗量减少91%， 色谱峰的分离度得到提升。同时，相关物质的色谱峰数目由原来的32个增加至42个。
使用新的UPLC方法对洋地黄毒苷的样品进行了连续8针重现性的测试，洋地黄毒苷色谱峰面积的RSD为0.1%，方法重现性良好。
