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全二维气相色谱飞行时间质谱应用于人体尿液分析
前言
遗传性代谢缺陷病是有机酸、氨基酸、糖、脂肪、激素等多种物质代谢缺陷的总称，虽单一病种发病率低，但病种繁多，总体发病率较高。目前已认识的遗传代谢病已达500 余种。利用气相色谱-质谱（gas chromatography-time-of -flight mass spectrometry, GC-TOFMS）检测技术进行代谢性疾病的诊断，目前用此方法同时筛查氨基酸、有机酸、糖代谢异常及脂肪代谢紊乱等一百多种疾病。本研究采用柱前衍生化全二维气相色谱-飞行时间质谱（comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of -flight mass spectrometry, GC×GC-TOFMS）技术对人体尿液进行研究，结果共检测出535 个峰。同时，利用GC-TOFMS对人体尿液进行分析，共检出159个峰。与一维GC-TOFMS检出峰个数相比，GC×GC-TOFMS多检出376个峰，大大的丰富了样品信息。本研究可为人体尿液代谢性疾病的诊断提供更为丰富、准确的信息。
实验部分
主要设备
全二维气相色谱质谱联用仪（北京东西分析仪器有限公司，GC×GC-TOF MS 3300型）。
样品处理
取适量人体尿样于 塑料离心试管中，冰箱中冷藏 1h，然后以 4000r/min 离心 10min，取上层澄清尿样 2mL 于 10mL 的玻璃具塞试管中，加入5%盐酸羟胺水溶液，混匀，室温下进行肟化反应 ; 加入浓盐酸调节 PH 值为 1，加入氯化钠使水层饱和，然后用 6mL 乙酸乙酯提取，准确移取出 5mL，于氮吹仪中吹干，加入衍生化试剂（BSTFA+TMCS 99:1），混合，衍生化反应30min，反应完成后将其转移至 2mL 小样品瓶中，然后取 1uL 进 GC-MS 分析。
分析条件
GC方法：
一维柱：DB-5MS（25m×0.25mm×0.25μm）；
程序升温：70℃（5min）6℃/min 220℃(3min) 10℃/min 325℃(5min)；
进样口温度：260℃； 载气：高纯氦；
进样方式：不分流进样，开阀时间50s，阀开后分流30:1；
进样量：0.5μL； 流速：1.0mL/min，恒流； 溶剂延迟：4.5min。
GC×GC方法：
一维柱：DB-5MS（25m×0.25mm×0.25μm）；
程序升温：70℃（5min）6℃/min 220℃(3min) 10℃/min 325℃(5min)；
二维柱： DB-17HT（3m×0.25mm×0.15 μm）；
程序升温：70℃（5min）6℃/min 220℃(3min) 10℃/min 325℃(5min)；
进样口温度：260℃； 载气：高纯氦（纯度99.999%以上）；
进样方式：不分流进样，开阀时间50s，阀开后分流30:1；
进样量：0.5μL； 流速：1.0mL/min，恒流； 溶剂延迟：4.5min。
调制器方法：
调制器恒定温度：280℃；调制周期：10s，热吹0.4s。
TOF/MS 方法：
接口温度：250℃； 离子源温度：220℃：离子化能量：-70eV；检测电压：-1890V；
质量数采集范围：50-650 ；采集速度：100谱/秒（全二维）；采集速度：1谱/秒（一维）。
实验结果
按上述方法条件对尿液样品进行前处理和气质联用仪分析。图1和图2是GC-MS和GCxGC-TOFMS分析尿液样品色谱图。从图1可以看出，色谱图没有达到基线分离，共检出159种化合物。 图2可知，GCxGC-TOFMS共检出535种化合物，样品非常复杂，可以达到完全分离。全二维气质强大的解析能力, 让尿液样品复杂体系的完美分离成为可能。
对GC×GC-TOFMS检出的535个峰检索定性，NIST相似度大于70%，得到有机酸类、氨基酸类、糖类、醇类、酯类、酮类等 6 类物质共 204 种成分。检测结果中，有机酸数量为107种，相对含量为 52.45%，氨基酸类、糖类、醇类数量分别为22、22、23种，它们的相对含量基本相当，约为11%。图3为2D色谱图，图4为3D色谱图。
结论
全二维气相色谱飞行时间质谱联用仪运用东西分析仪器检测衍生化处理后的尿液样品，是尿液中氨基酸、有机酸、糖代谢及脂肪代谢分析和诊断的可靠方法。尿液经尿素酶处理后，三甲基硅烷化衍生化用全二维气质联用仪分析，专用数据处理软件对结果进行自动分析，操作简单方便。该方法准确，峰容量大，分离度高，给出样品丰富的信息，是筛查遗传性代谢病的有效手段。
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