Nature Genetics：借助粪便代谢组学分析肠道菌群的组成与功能

麦特绘谱

2018.8.09

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人体肠道微生物组在人体健康中起着至关重要的作用，越来越多的研究证据表明肠道微生物组有助于维持宿主的代谢稳态，反之菌群失衡将影响代谢物（如支链氨基酸、激素、维生素、短链脂肪酸）的水平从而导致肥胖、胰岛素抵抗等疾病的发展，可见代谢组和肠道微生物组密切相关。目前对肠道微生物组的分析多采用16S测序技术，但该技术存在一定局限性，如注释很少，并且微生物组提供的多是可能的微生物体而非其实际活性，也就是它并不能指示每个细菌基因组内基因的转录活性或者区分活细菌还是死的微生物体。粪便代谢组学则能更好的阐释宿主、饮食和肠道微生物群之间的代谢相互作用，并可以提供微生物组功能数据以弥补测序的不足。

粪便代谢物与年龄的相关性

Cristina Menni研究团队针对Twins UK队列中786名女性双胞胎粪便样本开展非靶向代谢组学分析，共检测到1116种代谢物，其中570个在至少80%的样本中被检出，345个在20~80%的样本中被检出。基于相同的平台进行786名女性双胞胎的血样非靶向代谢组学分析，找到469种共有的代谢物，647种粪便样本中独有的代谢物及432种血样中独有的代谢物，结果表明粪便代谢组可以补充血液代谢组学信息。经多重检验校正后，915种粪便代谢物与年龄之间不存在显著关联，但用80%的粪便样本中检测到的570种代谢物进行PLS-DA建模分析能够将研究人群中老龄人群（> 75岁，n=79）和年轻（<56岁,n=80）人群区分开（见Fig.2b），且Logistic回归分析发现植烷酸在两者间存在显著差异（P=0.0005,见Fig.2a）。以上结果表明粪便代谢组与年龄之间存在非线性关联，并与先前关于年龄对肠道微生物组影响的报道结果相吻合。

粪便代谢物与BMI &内脏脂肪的相关性

研究发现BMI与8种粪便代谢物（5种脂质、胆红素和两种未知代谢物）存在显著相关性，然而BMI是基于总重量而不区分肌肉、脂肪指数，是一种不精确的肥胖度量。随后采用内脏脂肪指数（测量腹部肥胖）进行关联，共发现102个统计学显著相关代谢物。先前的研究已发现内脏脂肪量与肠道微生物组成之间存在很强的关联。富集与内脏脂肪显著相关的代谢物主要包括43个氨基酸、14个脂肪酸（花生四烯酸等）、8个核苷酸、6个糖和6种维生素等。粪便代谢组与中心性肥胖之间的强烈关联证实了微生物氨基酸代谢参与肥胖发生的假设，并暗示了新的机制，如微生物参与的维生素B代谢。通过分析粪便代谢组，发现相同目或科的微生物丰度与氨基酸低丰度密切相关，表明菌群与内脏脂肪的相关性可能由可获取的氨基酸介导（Fig.3），这种关联可能是由于细菌的利用增加或者产生的氨基酸减少，或者可能是更复杂的宿主-微生物相互作用的结果，由此表明微生物代谢谱与宿主表型的关系比分类学更为密切。

粪便代谢物与宿主遗传的关联

为了研究宿主基因是否也会影响粪便代谢物，本研究采用双胞胎（单卵〈MZ，n=148对〉和双卵〈DZ，n=155对〉）进行研究，发现MZ之间的代谢特征比DZ双胞胎更相似（Fig.4），并用ACE模型分析了粪便代谢物的遗传度。环境因素对脂质的影响明显强于其他代谢物（P<0.0002）。接下来对428种可遗传的代谢物进行全基因组关联研究，鉴定了与遗传基因显著相关的三种代谢物（氨基酸：3-苯基丙酸和两种脂质：二十碳五烯酸和3-羟基己酸）（Tab.1,Fig.5a），又测试了31226个代谢物比值和遗传基因的相关性，发现只有咖啡因代谢的产物5-乙酰氨基-6-氨基-3-甲基尿嘧啶与1,3-二甲基尿酸盐比率和8号染色体上的基因座（rs35246381）显著相关（Tab.1,Fig.5b），并在包含230个人的独立样本集中得到验证。两者的比例与咖啡摄入量和血清咖啡因水平呈正相关。该基因座位于NAT2基因，可编码N-乙酰转移酶，催化咖啡因代谢物的降解。NAT2酶还参与各种外源性物质的代谢，肠道微生物组已被证明可调节外源物质酶，如无菌动物大肠中NAT2的表达比对照组高1.5倍，由此表明外源物质代谢可以通过宿主遗传基因变异和肠道微生物组组成共同调节，并且宿主遗传组成和外源物质浓度之间的联系可以在粪便代谢物中得到捕获。

粪便代谢组与肠道微生物组高度相关

对微生物多样性的代谢物水平进行回归分析，在FDR 5%水平上发现575种代谢物与微生物多样性（Shanno指数）显著相关，其中347种在Bonferroni校正后仍显著相关。使用未加权的UniFracβ-多样性分析发现肠道微生物组成解释了710个代谢物平均67.7％（±18.8％）的变异，微生物组解释了8个BMI相关代谢物及101个内脏脂肪相关代谢物中很大比例的变异，此外，外源性物质与微生物组成存在最强的相关性。针对581个最丰富的OTU与代谢物进行分析，调整潜在的混杂因素（如Shannon多样性），发现907种不同代谢物与579种不同的OTU（FDR <5％）存在42645个显著关联。进行粪便代谢物与分类学（从属到门水平）关联分析，发现264个代谢物仅在OTU水平与微生物相关，其余的与更广泛的分类群相关。将435个具有已知化学特性的常见代谢物与241个OTU组合（至少在属的水平上完成分类）进行高斯图模型分析。得到的模型由2,553个独立的关联组成，其中代谢物1,035个，微生物946个，代谢物和微生物相关572个。在最大的组分中检测到19个簇，其中9个包含微生物和粪便代谢物，其中10个仅由代谢物组成，外源性物质具有更高的节点度（P <0.003）且与OTU的密度更高（P <0.0024），上述模型表明肠道微生物组和粪便代谢组之间存在高度相关性。

小结与展望

本研究基于TwinsUK的786名女性双胞胎队列粪便样本开展非靶向代谢组学研究，共检测到1116种代谢物，分别对粪便代谢物（i）与年龄、性别和肥胖；（ii）与宿主遗传；（iii）与肠道微生物组组成进行了相关性分析。研究发现粪便代谢组仅受宿主遗传学的中度影响（遗传度<H2>= 17.9％）。其中，NAT2基因的一个被重复验证的基因座与粪便代谢性状相关。此外，粪便代谢组在很大程度上反映了肠道微生物组成情况，平均解释了其方差的67.7％（±18.8％）。结果表明粪便代谢组与BMI、内脏脂肪量、宿主遗传和肠道微生物密切相关，可见粪便代谢组是探索微生物组成、宿主表型和复杂遗传性状之间联系的新工具。

尽管先进的宏基因组测序实现了物种和微生物途径的定量和功能注释，但16S测序存在缺乏定量功能注释的局限性，代谢组学为微生物代谢提供了互补的功能数据及其与宿主、环境因素之间的关联。本研究着重关注粪便代谢物与宿主和微生物遗传之间的关系。未来的研究应进一步关注环境因素，特别是营养的影响，并应考虑大便次数/类型对粪便代谢物测量的影响，这些因素已知与粪便微生物组成有关。粪便代谢组可作为反映宿主-微生物组相互作用的中间表型，是补充未来基因组和微生物组研究的有力工具。

参考文献：

Zierer J, Jackson M A, Menni C, et al. The fecal metabolome as a functional readout of the gut microbiome[J]. Nature Genetics, 2018:790-795.