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饮食、遗传及肠道微生物驱动血浆和盲肠代谢物的动态变化

麦特绘谱

2018.8.03

肠道微生物群的组成是影响全身代谢的重要因素之一，微生物群落的种类及其对环境因素（饮食、抗生素等）的响应变化取决于宿主的遗传背景，而微生物群的变化与肥胖、糖尿病和代谢综合征的发展紧密相关。肠道微生物利用膳食成分产生能量和代谢物，代谢物被吸收进入血液进一步代谢或者影响宿主代谢。菌群代谢物对宿主代谢的影响存在利弊双方面。例如短链脂肪酸通常对宿主是有益的，可抗肥胖和抗糖尿病，但N-亚硝基化合物、氨和硫化氢却可以诱导活性氧（ROS）和DNA损伤并激活炎症途径；膳食胆碱的终产物TMAO可促进动脉硬化并与心血管疾病（CVD）、中风和死亡相关；肠道微生物群产生的脱氧胆酸促进肝细胞癌的发展。此外还有许多菌群代谢物可以通过饮食和抗生素治疗等因素进行修饰，菌群代谢物被吸收进入循环系统被宿主代谢为可以作用于组织并影响宿主代谢的生物活性化合物。C57BL/6J（B6J）小鼠肥胖和糖尿病易感型，129S1/SvImJ (129J)小鼠则肥胖和糖尿病抵抗型，129S6/SvEvTac(129T)小鼠肥胖易感但不会产生代谢综合征。这三种品系的小鼠是研究遗传、饮食和菌群互作的理想模型。本研究利用上述三个不同品系小鼠（B6J, 129J和129T），研究高脂和抗生素干预下菌群和代谢物的变化，探讨代谢在饮食、遗传、菌群之间相互影响中的重要作用。

饮食，遗传和抗生素影响肠道微生物结构

B6J, 129J和129T三个品系小鼠正常饮食6周后，将每个品系的小鼠随机分为三组，分别给予正常饮用水（对照组）、含万古霉素（vancomycin，V）的饮用水(1g/L)、含甲硝唑（metronidazole，M）的饮用水(1g/L)。一周后抗生素组和一半对照小鼠追加高脂饮食（HFD）4周，以评估饮食和抗生素对肠道微生物群和新陈代谢的影响。结果显示HFD喂养使体重增加（B6J> 129T> 129J）且不受V或M的显著影响（Fig.1A）；B6J小鼠的血糖、胰岛素抵抗（HOMA-IR）高于129小鼠，并且在B6J小鼠中HOMA-IR通过V处理而降低（Fig.1C）。HFD喂养显著降低了所有品系小鼠的盲肠重量，而通过抗生素干预后盲肠重量恢复甚至超过正常饮食水平（Fig.1D），这种对盲肠的影响可通过给无菌小鼠移植菌群重现；盲肠内容物的16S rRNA数据经PCA分析显示不同实验组之间的群落结构存在明显差异（Fig.1E），HFD和抗生素处理对细菌结构具有强烈影响，在门水平上，与B6J小鼠相比，129品系中厚壁菌门对拟杆菌的相对丰度更高（Fig.1F），HFD使所有小鼠品系中的拟杆菌降低，且抗生素使B6J和129J小鼠仅存厚壁菌门，其他大部分细菌被消除，而129T小鼠仍有相当数量的变形菌和疣粒菌存在。

微生物修饰影响微生物组中预测的功能途径

对16S rRNA数据进行PICRUSt分析预测菌群宏基因组的功能组成以探索不同菌落的潜在影响。结果显示HFD喂养V处理的B6J和129J小鼠中碳水化合物代谢、嘧啶代谢、淀粉和蔗糖代谢、氰基氨基酸代谢、苯丙烷类生物合成、酪氨酸代谢、丙酮酸代谢和糖异生途径显著上调，苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成途径下调，M处理组和V处理的129T小鼠中均未显示上述通路的改变（Fig.2A）。所有小鼠品系中的两种抗生素都下调了半乳糖代谢和精氨酸和脯氨酸代谢的途径，M处理后则增加了所有菌株的醛脱氢酶表达、支链氨基酸降解、丁酸代谢和脂肪酸代谢途径（B6J> 129J> 129T）。即使单用HFD也会以菌株依赖性方式调节多种代谢途径。因此，由HFD和抗生素处理产生的细菌群落变化会改变多种微生物代谢途径，并且在三种小鼠品系中产生不同的效应。

通过肠道微生物修饰改变盲肠和血浆代谢

采用LC-MS非靶向代谢组学分析盲肠内容物和血浆代谢物，以验证宏基因组预测代谢途径中代谢物的变化。盲肠内容物共检测到49,712个峰，鉴定了482个代谢物，约20,000+峰未被鉴定；血浆中共检测到19,627个峰，鉴定到374个代谢物，约11,500峰未被鉴定。尽管用相同的饮食饲养且在相同的饲养箱中，盲肠代谢物的PCA分析显示三种小鼠品系的高脂饮食和抗生素治疗组间明显分离（Fig.2B）。盲肠和血浆代谢物热图分析显示盲肠中饮食显示的变化大于血浆，高脂肪饮食使所有小鼠品系盲肠中多种胆汁酸水平显著增加，且通过V或M干预可大大逆转（Fig.3A）；正常饮食和HFD小鼠血浆中多数胆汁酸水平相似，但抗生素治疗确实降低了次级胆汁酸牛磺脱氧胆酸的水平，盲肠中也出现类似变化趋势（Fig.3B）。

HFD抗生素治疗小鼠的显著代谢物反应

不同肥胖和糖尿病倾向的小鼠品系在饮食和抗生素干预后表现出不同的代谢应答。如高脂饮食可致B6J和129J小鼠盲肠内嘧啶代谢物（尿苷、胞嘧啶、胸苷、2-脱氧胞苷）降低，这种降低可被V处理逆转，而M处理却会进一步增强降低的趋势，这和PICRUSt预测的结果一致，血清并不能反映盲肠的波动，M处理后尿苷反而是增加的。嘌呤代谢（AMP、ADP、cAMP）、支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）、脂肪酸（硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸）、脂质（C34:3 PE、C30:0 PC）、吲哚氧基硫酸盐等在不同的小鼠品系、饮食、抗生素治疗中亦表现出了复杂的应答变化，见Fig.4A-F。为深入了解盲肠和血浆代谢物谱与肠道微生物组之间的关系，作者对组氨酸和芳香族氨基酸（色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸）代谢途径在不同品系盲肠、血浆中的变化进行了探讨。肠道菌群代谢是血浆中组氨酸代谢产物乙酰组胺和3-(4-咪唑)丙酸以及苯丙氨酸代谢物苯乙酰甘氨酸的主要来源。M处理后，所有品系小鼠盲肠中色氨酸均降低，显示菌群在色氨酸代谢中的核心地位，但只有部分代谢物能反映到血浆中，如吲哚-3-乙酸。

代谢物与胰岛素抵抗相关

对小鼠饮食和治疗组血浆代谢物水平的变化与胰岛素抵抗进行相关性分析，结果显示氨基己二酸，α-羟基丁酸，乙酰甘氨酸，C16-肉碱，N-氨基甲酰基-β-丙氨酸，胸苷，肌肽，4-吡哆酸，C34:4 PC和C30:0 PC与胰岛素抵抗呈显著正相关（Fig.6A）；己二酸，C34：2 PC缩醛磷脂，C36：2 PC缩醛磷脂，C38:6 PC缩醛磷脂，C58:6三酰基甘油（TAG），C58:7 TAG，牛磺胆酸和胍基乙酸盐均与胰岛素抵抗呈负相关（Fig.6B）。其中2-氨基己二酸，α-羟基丁酸和N-乙酰甘氨酸已在临床研究中被鉴定为糖尿病风险和胰岛素抵抗的潜在生物标志物，这些物质是具有较低脂肪酰基碳数和含有双键的脂类。Fig.6C显示胰岛素抵抗高度相关的代谢物与特定的肠道微生物相关性，其中关联最显著的OTU是厚壁菌门（Firmicutes）梭菌目毛螺菌科（Lachnospiraceae），其他梭菌如Clostridium XIVa，与C58:7 TAG呈正相关，C58:7代谢物与胰岛素抵抗呈负相关；与N-氨基甲酰-β-丙氨酸和α-羟基丁酸呈负相关，与胰岛素抵抗呈正相关。此外与胰岛素抵抗负相关的己二酸与三种拟杆菌属物种（Otu00115，Otu00119和Otu00179）呈正相关。

非靶向代谢组学检测未知血浆代谢物的动态变化

除了400种已识别代谢物外，血浆中大约还有20,000个可重现的未知峰，且许多显示出对饮食或抗生素具有动态变化。通过热图确定了HFD或一种或两种抗生素显著增加或减少的未知物，借助METLIN数据库和相关标品，鉴定为丙酸咪唑、N-乙酰赖氨酸、皮质酮和5-羟基-4-甲基尿嘧啶。但仍有大量未知物有待确定尤其是许多变化超过饮食或抗生素治疗的26倍（64倍），并且在三种小鼠品系中表现出同样大的差异的代谢物。例如代谢物m15618不受HFD影响但在B6J和129J小鼠的血浆中用V处理下降32,768倍。因此准确鉴定高度调节的未知代谢物将有助于更深入地了解肠道微生物组如何影响全身新陈代谢。

小结

本研究通过对正常饮食、HFD和HFD补充万古霉素或甲硝唑的B6J, 129J和129T小鼠的血浆和盲肠内容物进行LC-MS非靶向代谢组学分析，结合16S rRNA PICRUSt分析预测肠道细菌的功能性宏基因组，揭示了饮食、基因和菌群对代谢的影响。其中18种血浆代谢物与动物品系和饮食中的胰岛素抗性呈正或负相关（例如具有2-氨基己二酸水平的个体未来患糖尿病的风险高出4倍），超过1000个未被鉴定的代谢物峰也受到饮食、抗生素和遗传背景的高度调节，因此了解全套代谢物及其对扰动的反应将为肠道微生物组的变化如何影响全身代谢及其对糖尿病和肥胖的改变提供新的见解，由此可见代谢物的动态变化是饮食、遗传和微生物组综合作用的结果。

参考文献

Fujisaka S, Avila-Pacheco J, Soto M, Kostic A,Dreyfuss JM, Pan H, et al. Diet, Genetics, and the Gut Microbiome Drive Dynamic Changes in Plasma Metabolites. Cell reports. 2018 Mar 13;22(11):3072-86.