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Nature Communications：单分子力谱揭示COVID-19侵袭动力学

布鲁克纳米表面仪器

2020.11.05

布鲁克文章推荐第45期

Bruker Journal Club

布鲁克纳米表面仪器部王鑫博士

2020年，COVID-19病毒肆虐全球，在全球范围内导致了累计四千万人感染，夺去了一百万人的生命，造成了难以估量的经济损失。针对COVID-19相关病毒入侵机制、抗病毒药物研发的研究成为了全球焦点。比利时鲁汶大学的David Alsteens团队使用单分子力谱技术研究了COVID-19的S糖蛋白与细胞膜ACE2受体的结合动力学，并通过结合强度变化展示了几种ACE2衍生多肽在抗病毒药物开发的潜在应用。相关工作(Molecular interaction and inhibition of SARS-CoV-2 binding to the ACE2 receptor)于2020年5月21日公布在预印网站ResearchSquare上，并于2020年9月11日发表在Nature Communications上(doi.org/10.1038/s41467-020-18319-6)。

COVID-19病毒通过膜表面的刺突糖蛋白(spike glycoprotein, S糖蛋白)与宿主细胞膜表面的血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2受体)相互作用介导进入宿主细胞。S糖蛋白位于COVID-19病毒表面，为三聚体结构，具有两个亚基，S1亚基包含受体结合结构域(RBD)实现与宿主细胞的受体结合，S2亚基参与病毒与细胞膜的融合过程（图1b）。该研究利用原子力显微镜，使用基于力曲线的成像模式研究了COVID-19的S糖蛋白S1亚基在ACE2模型表面与活细胞膜上ACE2受体结合的生物物理特性(图1c)。并通过对病毒S糖蛋白的靶向ACE2衍生短肽结合情况的研究，发现这几种肽抑制剂的显著的结合抑制特性。

S1亚基与ACE2受体特异性结合动力学

作者首先使用单分子力谱技术研究了模式表面上ACE2受体与S1亚基的结合动力学。在力曲线中识别出S1亚基与ACE2受体结合的事件，再在这些事件中提取S1亚基与ACE2的解离力与解离发生时对应的力加载速率(loading rate, LR)。使用Bell-Evans模型对解离力-LR进行拟合，可以获得S1亚基-ACE2受体相互作用的动力学参数，即解离速率常数koff与反应坐标xU。根据这些动力学参数可以获取该相互作用的自由能能垒(图2a~f)。对S1亚基或单独RBD区域与ACE2受体相互作用的研究表明，两者具有十分相近的动力学参数，且与前人基于SPR方法测得的数据吻合。使用单分子力谱技术还可以估算配体与受体的结合速率(kon)(图2g、h)。解离速率与结合速率的评估与对照实验(图2c)的引入，均展示了这一结合的特异性。

S1亚基在活细胞上的结合动力学

在模式表面建立的S1亚基与ACE2结合动力学需要在活细胞表面进行进一步检验。作者选取了A549作为模型细胞。该细胞可以少量的表达ACE2受体，而ACE2过表达的A549细胞可以诱导病毒的入侵。因此使用常规A549细胞(对照)与转染了ACE2-eGFP的A549细胞作为病毒的感染模型。共荧光共聚焦成像表明过表达的ACE2受体均匀的以岛形分布在细胞膜表面(图3b)。通过荧光共聚焦成像的帮助，选取对照细胞与转染细胞交界处进行基于力曲线的AFM成像实验(图3c)。基于力曲线可以获取细胞的AFM形貌图与黏附力图(图3d、e)，而黏附力图则对应着力曲线中的S1亚基与ACE2的结合事件(图3g)。统计显示，过表达ACE2的A549细胞有着更高的结合率(图3f)。为了更好的进行动态力谱分析(DFS)，通过改变峰值力轻敲模式的振幅与频率，可以获得更广域的力加载速率(图3g)。基于细胞膜表面ACE2受体与S1亚基获取的相互作用力与力加载速率的关系，可以很好的符合模式表面获得的Bell-Evans模型参数，证实了模式表面获取数据的生理相关性(图3h)。

S1亚基在活细胞上的结合的多通路分析

前人的研究表明，人源的S糖蛋白S1亚基拥有唾液酸的结合位点，整合素受体也是诱导COVID-19入侵宿主细胞的通路。因此唾液酸与S1亚基结合或cRGD与整合素结合都可能干扰COVID-19入侵宿主细胞。实验表明，唾液酸的加入使得ACE2过表达A549细胞、对照组A549细胞与S1亚基的结合概率有了显著下降(图3f)。而cRGD的加入与对实验组、对照组的影响均不明显(图3f)，这与整合素倾向于在细胞底部表达吻合，因此细胞顶部主要为S1糖蛋白与ACE2受体的结合事件。

ACE2衍生多肽抑制S1亚基与模式表面或活细胞表面ACE2受体结合

在测量S1亚基与模式表面的ACE2受体结合时，在环境中加入不同浓度的ACE2衍生多肽，通过竞争作用抑制结合。统计表明，浓度在1 μM时即可实现显著的抑制作用(图4)。在ACE2过表达A549细胞表面的结合抑制实验中，[22-57]ACE2衍生多肽表现出了良好的抑制性，结合概率下降了~70%(图5)。展示了衍生多肽在抗病毒抑制剂开发中的潜在性能。