干货丨从质谱研究病毒复制说起:稳定的负离子模式 TVNM
多数时候,人类在历史上对传染疾病的胜利,都是靠自身免疫系统对病毒的抵御并自愈。
目前为止,没有有效药物能直接杀死病毒(任何文章只要号称是直接杀死病毒的特效药都可以打入冷宫),防为主治为辅。对未感染的人群:1、疫苗激活人体免疫能力,提前对病毒产生抗体;2、隔离、物理防护、消毒等方式阻止疫情蔓延。对已感染的人群:1、抑制类抗病毒药物阻断病毒复制;2、激素类药物或其它方式激活人体免疫系统,正面与病毒作战。
1918 年爆发的西班牙流感,则没有这样全面的医疗系统来应对,对已感染的人只能任凭其发展,唐顿庄园里这款烈性传染病就短时间致死大表哥马修的前未婚妻。在第二波感染的记录中,很多人早上染病,从症状开始到死亡不足 12 个小时,有的人上了公交车,直接就在公交车上毙命。
幸运的是,到 1920 年 12 月,历时 3 年的病毒大屠杀终于撤退。
回看历史,总是希望能够明智。
目前肆虐在全球的新型冠状病毒和 HIV-1 即人类免疫缺陷病毒1型(俗称艾滋病毒)一样,都是一种 RNA 病毒。病毒靠自我复制,实现体内增值。复制过程中的一个关键步骤就是 RNA 需要和核衣壳的 Gagpolyprotein 结合,这种结合是非共价的。HIV-1 RNA 有 SL1-SL4 保守区域,可以和 Gag 结合。如果药物(inhibitor)能和 SL1,SL2,SL3,SL4 结合,就有可能抑制 RNA 和 Gag 的结合,从而抑制病毒复制。
通常的纳升级电喷雾 nESI 负离子模式很不稳定,而 RNA 是带负电荷的,必须使用负离子模式。于是研究提出:利用自动化的芯片多通道纳喷(TriVersa NanoMate,TVNM)质谱技术在负离子模式下研究 RNA 和一些可能的小分子药物的非共价作用。TVNM 负离子模式是很稳定的,在研究非共价相互作用方面有成功的应用,以期该方案对加速开发抑制病毒疫情的大小分子药物,有启发和借鉴意义。同时,TVNM 在研究非共价相互作用方面表现出色,也是天然蛋白质的研究和促进生物抗体药物发现的解决方案。
非共价健相互作用 Noncovalent Interactions
(e.g. QTof micro MS with 30-40 V cone voltage and 45-100ºC source temperature)
结果分析
图1. 仅 3.5 µM RNA-SL4 的 10min 的平均质谱数据,分子量 MW=6476.9(插图显示 MaxEnt1 解卷积分子量 MW=6476)
RNA SL4 在 m/z 1000-1800 之间显示出强大的电荷分布,其中最高信号出现在 m/z 1300 处的负五价电荷态。
图2. 将 3.5 µM RNA-SL4 与 5 µM 妥布霉素(分子量 Mw = 467.5,蓝色)和 0.5 µM 新霉素 B(分子量 Mw = 614.6,绿色)一起孵化。(插图显示了 MaxEnt1 解卷积分子量)。
配体筛选显示新霉素 B 和妥布霉素均与 RNA 结合,质量变化与计算值一致(理论分子量 6476.9)。
图3. 利用不断增加浓度的新霉素 B 滴定 3.5 µM RNA-SL4(黑色 0.1 µM < 10% 结合,蓝色 0.5 µM > 90% 结合)。
Kd 预估值为 2 µM (文献值 1.0 ± 0.2 [Turner et al. 2006]
Sensitive identification, characterization, and quantification of intact proteins
完整蛋白的特异性识别、表征和定量
促进生物制药和生物研究
变性蛋白通常使用液质(LC-MS)分析,但许多生物制药和生物学研究需分析完整蛋白。Exactive Plus EMR 质谱仪将超高分辨率的 Orbitrap 技术与扩展质量范围(EMR)功能相结合,配以芯片多通道纳喷源(TriVersa NanoMate)用于研究三级和四级蛋白的组成及內部结构。常见的靶标物包括单克隆抗体中的杂质、抗体-药物偶联物(ADC)、蛋白寡聚体药物、糖型和蛋白组装。
曲妥珠单抗(Herceptin®)是一种干扰 HER2 / neu 受体的单克隆抗体,主要用于治疗患有特定乳腺癌的患者。TVNM-Exactive Plus EMR 系统轻松分离变性和原态非变性的曲妥珠单抗的亚型,通过精确质量准度确定其糖基化水平。
TVNM-Exactive Plus EMR 轻松区分具有不同有效负载水平的抗体药物偶联物。
Data courtesy of Albert J.R. Heck et al., Utrecht University
TVNM-Exactive Plus EMR 非常适合用来研究抗体-抗原的结合。图谱中天然抗白介素 6 与 IL-6 抗原结合,可轻松分辨多个结合度以及具有相似质荷比 m/z 的糖型(插图)。
研究天然蛋白和蛋白复合物的解决方案,核心配置为:
有扩展质量范围的 Exactive Plus EMR 质谱仪 (ThermoFisher) ; 多通道纳喷源 TriVersa NanoMate® (Advion),提供持久、稳定且全自动的纳升注射纳升电喷雾 nESI,实现完整蛋白的高通量分析; Nanospray Flex 离子源 (ThermoFisher),灵活、稳定、灵敏纳喷; Dionex™ UltiMate™ 3000 纳流 nanoLC (ThermoFisher),加快分析速度、提高分离度并降低分析成本; 蛋白反卷积软件 (ThermoFisher) 对完整蛋白的谱图进行更有效、准确的反卷积计算。
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