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前沿 | 代谢流与 Seahorse 整合分析深入揭示造血干细胞能量代谢机制

安捷伦视界

2021.2.03

造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells，HSCs）是指具有自我更新能力并具分化成各类成熟血细胞如红细胞、白细胞和血小板等的潜能。造血干细胞代谢特性与其干性间的关系探究对血液疾病及血液相关肿瘤研究有着非常重要的意义。由于造血干细胞的可用数量及传统分析方法的受限，有关造血干细胞的能量代谢与不同发育阶段干性之间的联系仍然未知。近年，随着代谢流及细胞实时能量代谢分析平台 Seahorse 技术的发展，可以为干细胞前沿研究提供有力工具：代谢流利用稳定同位素示踪技术可以基于关注的目标通路追踪通路的动态状态，Seahorse 在活细胞水平提供糖酵解与线粒体能量代谢的功能验证数据，最终为干细胞代谢机制的揭示提供关键数据。

近期，在 Blood（IF 17.5）期刊发表了此领域最新论文^[1]，作者基于前期建立的新型遗传编码代谢感受器（SoNar）^[2]，对 HSCs 的独特代谢特性和调控机制进行了深入阐释，代谢流及 Seahorse 分析在其中扮演了重要角色。

研究的整体策略

利用遗传编码 NADH/NAD+代谢感受器（SoNar）的高灵敏、宽动态范围监测的优势，建立 SoNar 转基因小鼠品系并开发新型活体成像分析
进一步基于 SoNar 荧光比率区分不同的胎肝造血细胞 (FL-HSCs) 群
成像结合分子生物学及代谢流、实时细胞能量代谢等手段全面研究 SoNar 低与 SoNar 高细胞群的代谢及功能特性
最终揭示 FL-HSC 自我更新及分化的机理机制

在上述研究策略中，借助安捷伦的定性代谢流和 Seahorse 能量分析，鉴定了造血干细胞在不同发育阶段的代谢特征和调控机制，为临床应用提供了新的科学依据。采用代谢流对糖酵解与 TCA 通路进行稳定同位素示踪分析

采用 Agilent 6545 LC/Q-TOF 及 VistaFlux 代谢流分析流程，以 [U-¹³C] 葡萄糖为示踪剂，对 SoNar 低和高的造血干细胞群的糖酵解及 TCA 代谢通路进行代谢状态示踪分析。

图1：安捷伦 LC/Q-TOF 代谢流及 Seahorse 分析平台研究结果表明，SoNar 低与 SoNar 高的 FL-HSCs 相比，前者具有显著增强的 TCA 的循环。而更为有意思的结果，SoNar 低与 SoNar 高的 FL-HSCs 糖酵解水平相当。

图 2 糖酵解和三羧酸循环代谢流分析结果Seahorse 在活细胞水平测定细胞能量代谢特征

进一步利用 Seahorse 在活细胞水平对代表糖酵解的胞外酸化率 ECAR 和代表线粒体呼吸功能的氧气消耗率 OCR 进行实时分析。分析结果表明，代表线粒体呼吸水平的 OCR 值，SoNar 低的 FL-HSCs 要高于 SoNar 低的 FL-HSCs，而代表糖酵解水平的 ECAR 值两个细胞群是相当的，与代谢流的研究结果相互验证。

图 3 Seahorse OCR 与 ECAR 值测定结果以高灵敏度、宽动态范围的 SoNar 技术及新型活体成像技术为核心，文章还结合了流式细胞、PCR、免疫印迹分析等不同的表征手段，最终实现了对HSCs的独特代谢特性和调控机制的深入阐释。结论

该研究通过 SoNar 技术，建立新型造血干细胞代谢成像体系，揭示了 HSCs 以氧化磷酸化为主要能量来源的独特代谢特性，以及代谢状态决定 HSCs 在干性维持和特定骨髓微环境中的定位等关键细胞命运的新规律。该研究通过揭示早期 HSCs 的代谢特征及其与命运决定的关系，从代谢的角度理解 HSCs 的发生（AGM期）、扩增（胎肝期）、维持、恶性转化的分子机制，为 HSCs 的体外扩增及其临床应用寻找新的突破口，为治疗血液系统相关疾病提供新的思路。文中代谢流与 Seahorse 的整合应用，亦可以为 HSCs 或其他干细胞的代谢研究提供重要借鉴。参考文献

Gu H, Chen C, Hao X, Su N, Huang D, Zou Y, Lin SH, Chen X, Zheng D, Liu L, Yu Z, Xie L, Zhang Y, He X, Lai X, Zhang X, Chen GQ, Zhao Y, Yang Y, Loscalzo J, Zheng J. MDH1-mediated malate-aspartate NADH shuttle maintains the activity levels of fetal liver hematopoietic stem cells. Blood. 2020 Jul 30;136(5):553-571.
Zhao Y, Hu Q, Cheng F, Su N, Wang A, Zou Y, Hu H, Chen X, Zhou HM, Huang X, Yang K, Zhu Q, Wang X, Yi J, Zhu L, Qian X, Chen L, Tang Y, Loscalzo J, Yang Y. SoNar, a Highly Responsive NAD+/NADH Sensor, Allows High-Throughput Metabolic Screening of Anti-tumor Agents. Cell Metab. 2015 May 5;21(5):777-89.