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双平台代谢组学 | 基于LC-MS和GC-MS的非靶向代谢组学研究印楝素对背侧双歧杆菌幼虫的影响

鹿明生物

2021.3.03

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鹿明

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● 前言

2020年11月华南农业大学张志祥课题组在Scientific Reports期刊上发表题为“Integrated LC–MS and GC–MS based untargeted metabolomics studies of the effect of Azadirachtin on Bactrocera dorsalis larvae”的研究成果。通过LC-MS和GC-MS的非靶向代谢组学研究方法，研究分析内源性代谢物的变化以及印楝素对背侧双歧杆菌幼虫的生化作用。为印楝素应用在农药中主要活性成分提供了新见解。

中文标题：基于LC-MS和GC-MS的综合非靶向代谢组学研究印楝素(Azadirachtin)对背侧双歧杆菌幼虫的影响

研究物种：背侧双歧杆菌幼虫

发表期刊：Scientific Reports

发表时间：2020年

运用生物技术：GC-MS代谢组学、LC-MS代谢组学（双平台代谢组学）

● 研究背景

印楝素对数百种节肢动物表现出优异的生物活性。然而，目前关于其对背侧双歧杆菌幼虫的生化作用的了解还不够深。背侧双歧杆菌幼虫是对热带和亚热带水果和蔬菜具有破坏性的多食性和入侵性昆虫害虫；人们发现这种东方果蝇会袭击许多类型的商业水果和各种农产品。

关于印楝素对背侧双歧杆菌幼虫作用的研究很少。苦楝树提取物可以有效地降低刚出生的背侧双歧杆菌幼虫的繁殖力、生育能力、以及胚胎后发育。本文研究印楝素影响昆虫内源性代谢产物在生化水平上发挥的作用，探究印楝素降低背侧双歧杆菌幼虫的寿命和繁殖力的影响。

● 研究方法

1.研究材料

在实验室中，将背双歧杆菌的种群保持在25±1°C，16：8 h(光照：黑暗)周期和70–80％RH下。幼虫饮食由玉米粉，酵母，蔗糖，纸巾，盐酸，苯甲酸钠，香蕉和水组成，而成虫饮食由水，酵母和糖组成。这些实验包含两组，即对照（CK）和1μg/ g 印楝素（Tr）。

2.组学分析

GC-MS非靶向代谢组学分析；

LC-MS非靶向代谢组学分析；

● 研究结果

1.GC-MS和LC-MS分析幼虫的生物活性研究

通过GC-MS非靶向代谢组学和LC-MS非靶向代谢组学分析代谢物谱发现，如图1a所示，就发育持续时间而言，实验（Tr）组的9.59±0.27天显着长于对照组（CK）组的8.23±0.11天（P <0.01）。如图1b所示，就生存率而言，Tr组的19.78±1.5％显着低于CK组的88.56±1.4％（P <0.001）。如图1c所示，Tr组的weight重量0.084±0.007 mg显着低于CK组的0.112±0.003 mg（P <0.05）。

图1 | 印楝素对背侧双歧杆菌幼虫的生物活性

数据表示为平均值±SE。*表示P <0.05，**表示P <0.01，****表示P <0.001。

2.GC-MS和LC-MS的PCA分析

PCA用于检查GC-MS代谢组学和LC-MS代谢组学分析数据的质量。他们证明所有CK、Tr和QC（质量控制）样本均在95％的Hotelling的T平方椭圆内，并且明显分成几类。在这些样本中未发现异常。在GC-MS代谢组学分析中，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）解释了所有样品总方差的28.4％和27％（图2a），在ESI−模式下，PC1和PC2解释了所有样本总方差的45.6％和13.8％（图2b）。在ESI +模式下，PC1和PC2解释了总方差的35.9％和23.9％（图2c）。

图2 | PCA得分图

来自（a）GC-MS；（b）背杆幼虫LC-MS代谢物谱中的负离子模式（ESI-）和（c）阳离子模式（ESI +）的PCA得分图；

3.GC-MS和LC-MS的最小二乘判别分析

通过最小二乘判别分析（PLS-DA）来区分对照组和印楝素的暴露组之间的代谢物。这些PLS-DA模型中的CK和Tr组在95％的Hotelling的T平方椭圆形内，并显示出清晰的分离度（图3）。进一步进行了7倍内部交叉验证和200次排列检验，以评估这些模型的预测准确性和统计意义。

在GC-MS代谢组学分析中，PLS-DA模型的预测准确性参数为R2Xcum = 0.48，R2Ycum = 0.985和Q2Ycum = 0.843；其相应的统计显着性分别为R2 = 0.793和Q2 = -0.0593（图3a）。在ESI−模式下，PLS-DA模型的预测精度参数为R2Xcum = 0.576，R2Ycum = 0.999和Q2Ycum = 0.96；其相应的统计显着性分别为0.844和0.0944（图3b）；在ESI +模式下，PLS-DA模型的预测准确性参数为R2Xcum = 0.573，R2Ycum = 0.992和Q2Ycum = 0.959；其相应的统计显着性分别为0.859和0.107（图3c）。根据以下标准，如果左侧的所有蓝色Q2值均低于右侧的原始点，或者Q2点的蓝色回归线与垂直轴相交于零或零以下，则这些PLS-DA模型过度拟合的概率较低。以上结果表明，这些PLS-DA模型可以识别CK和Tr组之间差异富集的代谢产物。

图3 | PLS-DA得分图

（左）与相应的置换测试图（右）源自（a）GC-MS，（b）LC中的负离子模式（ESI-）和（c）正离子模式（ESI +)的MS代谢物谱。

4.GC-MS和LC-MS的总离子色谱图

在CK和Tr组之间改变了背侧双歧杆菌幼虫的代谢产物。相关的背侧双歧杆菌幼虫组织样品的GC-MS和LC-MS总离子色谱图（TIC）如图4所示。其显示了CK和Tr组之间的峰的形状和数量变化。在LC-MS代谢组学的ESI-和ESI +模式下，约7328和13375个代谢物峰被解卷积。相比之下，GC-MS代谢组学中有415个代谢物峰被解卷积。通过Metabo Analyst 4.028中的缺失值插补，过滤和标准化，进一步处理了这些反卷积数据。

使用现有数据库中的参考资料进一步注释了LC-MS中ESI-和ESI +模式下的总共1979个峰和3904个剩余峰以及GC-MS中的235个剩余峰。除去GC-MS中的副产物和LC-MS中的外源化合物后，根据PLS-DA模型的VIP值（VIP> 1.2）和Student''s t校正的P值（q值<0.05），选择差异丰富的代谢物。表1显示了LC-MS代谢组学分析中22种差异丰富的代谢物中的15种被上调。表2说明了GC-MS代谢组学分析中13种差异丰富的代谢物中的两种被下调了。如表1和表2所示，十种氨基酸和衍生物是差异最大的代谢产物，其次是七种碳水化合物，六种脂质，六种核苷，三种有机酸以及两种维生素和辅因子。

图4 | GC-MS/LC-MS离子图

从（a）GC-MS，（b）LC-MS中的负离子模式（ESI-）和（c）阳离子模式（ESI +）获得的背侧双歧杆菌幼虫组织提取物的典型TIC。左图为CK样品，右图为Tr样品

5.GC-MS和LC-MS的KEGG分析

通过Metabo Analyst 4.0对差异丰富的代谢物进行KEGG途径分析，来鉴定由Metabo Analyst所引起的代谢途径紊乱。使用存储在KEGG数据库中的参考图构建了示意图概述（图5），背侧双歧杆菌幼虫中存在的14种差异富集的代谢途径中的18种差异代谢物值得关注。

图5 | 代谢途径的示意图

用印楝素饮食喂养的背侧双歧杆菌幼虫中主要受影响的代谢途径的示意图。红色表示代谢物增加，绿色表示代谢物减少

作者将这些差异丰富的代谢途径总结为氨基酸，碳水化合物，核苷以及维生素和辅因子代谢。在这些差异丰富的代谢途径中，有七个的途径影响值超过0.1，这是途径富集和拓扑分析后的相关性阈值。基于负log（P）和影响值，作者表征了组氨酸代谢，d-谷氨酰胺和d-谷氨酸代谢，生物素代谢，抗坏血酸盐和藻酸盐代谢，戊糖和葡糖醛酸酯相互转化以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢作为印楝素对背侧双歧杆菌幼虫影响的重要相关途径；它们的影响值分别为0.5、0.33、0.25、0.25、0.22和0.17（图6）。

图6 | 代谢途径的代谢组图

背侧双歧杆菌幼虫特征的代谢途径的代谢组图（CK和Tr组）。显示了基于富集和拓扑分析的显着改变的途径。x轴代表途径富集，而y轴代表途径影响。大尺寸和深色分别代表主要途径富集和高途径影响值。

● 研究讨论

在这项研究中，人工加入印楝素可显着延长背侧双歧杆菌幼虫的发育时间，并降低背侧双歧杆菌幼虫成活率和体重。尽管这种情况与实地应用的实际情况大不相同，因为背侧双歧杆菌幼虫在果实内部，并且缺乏印楝素能穿透果皮和果肉的证据，但是代谢组学分析为印楝素对背侧双歧杆菌幼虫的生化影响提供了新的见解。

印楝素会显著减少脂肪酸的数量和相对组成。但是，在这项研究中，仅发现六个脂质或类脂质分子差异丰富，并且没有一个脂质代谢途径被富集。因此，应考虑针对脂肪酸或脂质组学的目标代谢组学，以研究印楝素对背侧双歧杆菌幼虫脂质的更全面的作用。

印楝素被证实会影响背侧双歧杆菌幼虫的碳水化合物代谢。在这项研究中，琥珀酸和苹果酸是TCA周期中两种差异富集的代谢产物。TCA循环（称为柠檬酸循环）具有两个重要功能。首先涉及用于合成氨基酸和脂肪酸的中间体化合物。另一个涉及大量ATP的形成，为各种合成过程提供能量，背侧双歧杆菌幼虫中此类代谢物的下调表明，在用印楝素饮食喂养的背侧双歧杆菌幼虫中，中间化合物和能量产生不足。木糖醇可以用于TCA循环中，并且可以通过戊糖和葡萄糖醛酸酯互变转化为木酮糖和阿拉伯糖醇，因此这些糖的相对含量变化有望影响能量的产生和中间化合物的产生，从而维持正常的生物过程。印楝素也被发现会影响背侧双歧杆菌幼虫的氨基酸代谢。谷氨酸参与许多生化途径，被认为是连接碳和氮代谢的关键代谢产物。组氨酸、d-谷氨酰胺和d-谷氨酸代谢以及丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢可导致处理后的背侧双歧杆菌幼虫谷氨酸含量升高，从而将含氮代谢物进一步转化为TCA循环以弥补不足能量和中间化合物。由于组氨酸通常在酶的活性位点中起关键作用，因此必须将其维持在相对较高的含量下，才能满足以印楝素饮食喂养的背侧双歧杆菌幼虫中酶反应的需要。印楝素还影响了背侧双歧杆菌幼虫的维生素和辅助因子代谢，包括生物素，也称为维生素B7或维生素H。在这项研究中，处理过的背侧双歧杆菌幼虫中生物素含量相对较高，可能与该辅因子在糖异生，脂肪酸合成和氨基酸分解代谢的中间代谢中发挥的关键作用有关。肌醇被认为是一种类似维生素的必需营养素。由于琥珀酸和苹果酸的下调导致中间化合物和能量的不足，因此肌醇通过半乳糖代谢转化为TCA循环，从而导致其含量相对较低。肌醇也可能部分导致了用印楝素饮食喂养的背侧双歧杆菌幼虫的生长不良，因为印楝素缺乏会导致消化和食物利用效率低下以及虾和鱼的生长不良。

● 研究结论

在LC-MS和GC-MS的代谢组学结果中，分别选择了一共22种和差异较大的13种代谢物，来分析印楝素对它们的作用。分析表明，14种差异丰富的代谢途径，包括7种有影响的途径，值得关注。进一步的代谢途径分析表明，印楝素对背侧双歧杆菌幼虫的组氨酸代谢，d-谷氨酰胺和d-谷氨酸代谢，生物素代谢，抗坏血酸盐和藻酸盐代谢，戊糖和葡萄糖醛酸酯相互转化以及丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢途径有影响。该发现说明印楝素对背侧双歧杆菌幼虫的初级代谢具有显著影响。

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在这项研究中，课题组测试了印楝素对背侧双歧杆菌幼虫的生物活性，介绍了一种使用UPLC-QTOF-MS和GC-Q-MS进行整合的非靶向代谢组学的方法，以探索内源性代谢物的变化及其潜在的生物学意义。虽然将本研究的生物活性结果推论到背侧双歧杆菌有害生物管理项目中是不合适的，但综合代谢组学分析表明，印楝素可能对背侧双歧杆菌幼虫的碳水化合物，氨基酸，维生素和辅助因子代谢产生重大影响，这为印楝素在农药中作为主要活性成分提供了新见解。

文末看点

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部分参考文献

1. Clarke, A. R. et al. Invasive phytophagous pests arising through a recent tropical evolutionary radiation: The Bactrocera dorsalis complex of fruit flies. Annu. Rev. Entomol. 50, 293–319 (2005).

2. Mulla, M. S. & Su, T. Activity and biological effects of neem products against arthropods of medical and veterinary importance. J. Am. Mosquito Contr. 15, 133–152 (1999).

3. Schmutterer, H. Properties and potential of natural pesticides from the neem tree, Azadirachta indica. Annu. Rev. Entomol. 35, 271–297 (1990).

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宇宙大王 撰文

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