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蛋白修饰如何验证？研究思路轻松get

精准医学与蛋白组学

2021.4.15

景杰学术/原创

蛋白质翻译后修饰（Post-Translational Modification，PTM）指的是在蛋白质氨基酸残基上通过添加或移除特定的基团进而调节蛋白活性、定位、表达以及与其他细胞分子相互作用的一种调控方式。已经有越来越多的研究发现，许多重要的生命活动、疾病发生不仅与蛋白质的丰度相关，更重要的是被各类蛋白质翻译后修饰所调控。因此深入研究蛋白质翻译后修饰对揭示生命活动的机理、筛选疾病的临床标志物、鉴定药物靶点等方面都具有重要意义。

目前已知的翻译后修饰类型超过400种，这些翻译后修饰极大的增加了蛋白组研究的多样性。常见的翻译后修饰类型主要有磷酸化、乙酰化、甲基化、糖基化、泛素化等[1]。同时近年来发现了一系列其他的新型酰化修饰，如琥珀酰化[2]、巴豆酰化[3]、2-羟基异丁酰化[4]等，这些新型酰化修饰无论是在结构、理化性质还是功能和调节方式上，与传统的乙酰化修饰都存在较大差异，是近年来发展很快、研究的热门方向。

图1. 翻译后修饰的功能

翻译后修饰作为生物学领域重要的研究方向一直都受到科学家的广泛关注。近些年来随着质谱技术的不断发展，蛋白质组学/修饰蛋白质组学作为一种强大的分析工具，已经被科研工作者广泛应用并在翻译后修饰领域发挥重要的作用。一个经典的修饰组学研究思路主要包括以下四个部分：

1. 首先通过修饰蛋白质组学对实验组和对照组进行前期的质谱检测，随后对鉴定或定量到的蛋白进行生物信息学分析，找到其中差异表达的蛋白或修饰位点；

2. 接下来就是数据的分析和验证，包括通过不同的分子生物学方法如点突变结合WB或者修饰PRM等技术在不同的实验体系中验证目标修饰位点的存在;

3. 在修饰位点验证的基础之上，进一步结合突变体、蛋白KD/KO、抑制剂等传统生物学方法进行功能实验，确认表型；

4. 最后通过互作蛋白和信号通路研究确定表型的作用机制，这样就构成了一个修饰组与传统生物学技术结合的翻译后修饰完整研究思路。

图2. 修饰蛋白组与传统生物学技术结合的翻译后修饰完整研究思路

在修饰蛋白组学研究中，质谱结果本身只能反映量的变化，生信分析主要是基于已有的结果进行统计，只是推测，并不是确证。因此修饰位点验证这一步非常重要，目标修饰位点的发现和验证是开启后续原创性工作，寻找生物学功能与分子机制的关键所在。下面小编就修饰验证最常用的实验方法给大家做下介绍。

点突变：点突变是修饰位点验证最常用的分子生物学方法，主要通过前期设计带有突变位点的引物结合PCR等技术向目的DNA片段（如质粒）引入所需特定位点的突变，进而改变DNA所表达目的蛋白的性状及表征。除了自己设计引物来实验之外，目前市面上已经有多种成熟的商业试剂盒可购买使用。进一步通过点突变构建的突变体结合其他生物学实验方法在体内体外进行后续验证。点突变技术是当前生物医学各领域研究中的一种重要实验手段，也是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有力工具。点突变的优势在于快捷、简单易操作，费用低，常用点突变方式见下表。

抗体WB：利用抗体进行WB验证是生物学实验中最广泛的研究方法，主要是通过针对特定修饰位点定制抗体并结合后续生物学方法来进行实验。其优势在于抗体验证研究思路成熟，实验方法广泛，发表文章认可度高等。但是也存在一定的缺陷包括抗体生产难、植物领域缺乏高质量的特异性抗体、一次验证多个蛋白较困难等。相对于传统的定制抗体，蛋白质修饰抗体的定制难度更高，而景杰生物独特的修饰抗体开发技术已助力多篇高水平文献的发表[5-9]。

修饰PRM: PRM技术是近些年来新兴的质谱检测技术，通过对特异性肽段或目标肽段进行选择性检测，从而实现对目标修饰肽段的靶向相对或绝对定量。因其精确的鉴定和定量能力，能够批量对蛋白进行靶向定量，荣膺Nature Methods杂志年度方法。相较于传统的抗体WB验证，修饰PRM具有以下几个优势：无物种限制，解决多领域修饰验证难的问题；无需依赖修饰抗体；PRM靶向验证更加精确；一次性验证多个修饰位点。因此，质谱作为研究翻译后修饰的最重要技术之一，不仅在前期修饰蛋白组筛选分析中发挥重要作用，随着技术的发展和研究的不断深入，质谱技术像修饰PRM也被越来越广泛的应用于修饰验证这个关键的步骤中并与传统的分子生物学技术结合，助力翻译后修饰领域研究。

图3. 三种常见的修饰验证方法

总结来看，在一个经典的翻译后修饰相关课题的研究思路中，修饰位点的验证非常重要，它是后续生物学功能和分子机制研究的基础，发挥着承上启下的关键作用。本文主要给大家着重介绍了3种常见的修饰验证的方法包括点突变、利用抗体进行的WB以及修饰PRM，尤其是修饰PRM作为新技术具有强大的优势，为修饰蛋白组学验证带来更多可能。

从修饰蛋白质组学大规模筛选到靶向蛋白质组学/修饰组学PRM验证，再到高品质抗体助力验证和后续分子机制研究，景杰生物提供的一站式蛋白质组学服务为各位老师的科研保驾护航。

如有合作需求，请致电景杰生物客服热线（400-100-1145）或咨询当地销售。

参考文献

1. Jensen, O. N., (2004) Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Current opinion in chemical biology.

2. Zhang, Z. et al., (2011) Identification of lysine succinylation as a new post-translational modification. Nature chemical biology.

3. Tan, M. et al., (2011) Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell.

4. Dai, L. et al., (2014) Lysine 2-hydroxyisobutyrylation is a widely distributed active histone mark. Nature chemical biology.

5. Kiran Kurmi, et al., (2018) Tyrosine Phosphorylation of Mitochondrial Creatine Kinase 1 Enhances a Druggable Tumor Energy Shuttle Pathway. Cell Metabolism.

6. Xiaopeng Lu, et al., (2019) GLP-catalyzed H4K16me1 promotes 53BP1 recruitment to permit DNA damage repair and cell survival. Nucleic Acids Research.

7. Liping Dou, et al., (2019) Protein lysine 43 methylation by EZH1 promotes AML1-ETO transcriptional repression in leukemia. Nature Communications.

8. Jue Jiang, et al., (2020) Direct Phosphorylation and Stabilization of MYC by Aurora B Kinase Promote T-cell Leukemogenesis. Cancer Cell.

9. Bo Wang, et al., (2020) SIRT2-dependent IDH1 deacetylation inhibits colorectal cancer and liver metastases. EMBO Reports.

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