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Nucleic Acids Res | CspC乙酰化助力铜绿假单胞菌在宿主体内“兴风作浪”
病原菌进入宿主后面临多重挑战，调整基因表达来响应环境变化对于细菌在宿主体内的生存至关重要。哺乳动物宿主的体温通常为37°C左右，是细菌毒力基因表达实现成功定植的关键信号[1]。前期的研究发现将近400个基因在温度变化时（28°C vs 37°C）显示差异表达，其中包括三型分泌系统相关基因。三型分泌系统（Type III Secretion System, T3SS）是革兰氏阴性菌的一个由多组分蛋白复合体形成的跨膜通道，它通过分泌蛋白，或把这些毒力蛋白直接注入宿主细胞中发挥致病作用[2]。三型分泌系统高度耗能，因此其表达受到严格调控，但具体调控机制尚不十分明确。
近日，南开大学吴卫辉教授课题组在Nucleic Acid Research（IF=16.97) 上发表题为Acetylation of the CspA family protein CspC controls the type III secretion system through translational regulation of exsA in Pseudomonas aeruginosa的研究论文，揭示了铜绿假单胞菌CspA家族蛋白CspC通过与exsA mRNA的5''UTR结合调控exsA的翻译。环境温度变化时，CspC乙酰化修饰增多影响其对核酸的结合能力，从而影响对exsA的翻译作用。景杰生物为该研究提供了基于LC-MS/MS的乙酰化修饰组学分析和乙酰化泛抗体（PTM-101）。
CspC抑制T3SS基因的表达
CspA属于冷休克蛋白家族，可与mRNA结合参与调控多种生物学过程及响应环境变化。铜绿假单胞菌野生型菌株PA14含有五个CspA同源基因，分别为PA0456 (CspC) , PA0961, PA1159, PA2622 (cspD)和PA3266 (capB), 它们都受到温度变化的调节。作者发现CspC的突变可增加肺部感染，且其毒力的增强与细菌的生长速度关系不大。接下来，作者探究了CspC的突变后细菌的毒力增强的原因。作者比较了突变体和野生型菌株的转录组，共发现174个差异基因。其中，所有T3SS基因在cspC突变体中表达都升高。同时，这一结果也在蛋白水平上得到一致的映证。这些结果表明CspC对T3SS基因有负调控作用。
图 PA0456（CspC）的突变增加了小鼠急性肺炎感染时的细菌毒力
CspC在转录后水平上调控exsA的表达
ExsA/C是T3SS的关键基因，CspC调控exsC启动子的活性，但不调控exsA启动子的活性。为了探究CspC对exsA的调节机制，作者在野生型菌株PA14中过表达C端带GST标前的CspC（CspC-GST）或单独的GST蛋白，并进行RIP-seq分析。结果显示，exsA mRNA及其5 ''UTR被 CspC-GST显著富集，表明CspC可能在转录后水平对exsA进行调节。随后，作者构建了Ptac-5’UTR-exsA-FLAG载体，通过不断缩短5’ UTR长度和观测表达量，最终将关键调控区域缩小到74 nt序列。
图 CspC 在转录后水平控制exsA的表达
温度升高促进CspC的蛋白乙酰化
利用Ptac-74 nt-exsA-FLAG，作者发现野生型PA14在37°C时的ExsA的蛋白水平比在25°C时高2.95倍。在cspC突变体中，exsA的蛋白水平分别比野生型PA14在25°C和37°C时高4.6倍和1.9倍，表明CspC在25°C时对exsA的翻译抑制作用更强。然而，CspC的转录和蛋白水平在两个温度下相差不大，暗示着差异可能由蛋白翻译后修饰引起。通过LC-MS/MS分析，作者发现CspC的K41位有乙酰化修饰，且这种修饰的丰度在37°C中高于25°C（从25°C到37°C，模拟细菌由环境中进入哺乳动物宿主体内)。
图 CspC蛋白K41存在乙酰化修饰
CspC K41的乙酰化调控T3SS基因的表达
为了探究K41乙酰化是否影响了CspC功能，作者构建了cspC的K41Q和K41R突变体版本，分别用于模拟乙酰化和未乙酰化状态。结果显示K41R CspC-74 nt ssDNA的亲和力比 K41Q CspC-74 nt ssDNA的亲和力约高10倍。过表达K41R cspC降低exsA、exsC和pcrV的mRNA水平，而过表达K41Q cspC 则不影响它们的表达。随后，作者使用Ptac-74-exsA-FLAG检测了cspC突变体对exsA翻译的影响。与野生型cspC相比，cspC K41Q突变后不能抑制exsA-FLAG的翻译，而K41R cspC可抑制exsA-FLAG 的产生，并导致在25°C和37°C下的exsA蛋白水平相当，即造成了对exsA翻译的组成性抑制。
图 CspC K41乙酰化调控 exsA 翻译
CspC 乙酰化在体内也参与调控T3SS
为了确认这种机制是否调控体内感染，作者用CspC天然启动子驱动的cspC-GST的突变体感染小鼠。与细胞实验相比，在从受感染小鼠中分离的CspC有更高水平的乙酰化。与cspC突变体相比，感染表达cspC (K41R) 的cspC突变体导致宿主细菌载量和宿主炎症反应降低。然而，cspC (K41Q) 不影响cspC突变体的细菌载量或宿主炎症反应。这些结果表明CspC在动物体内的活性受K41乙酰化的影响。
图 CspC K41位点突变影响CspC在体内的功能
综上所述，该研究确定了CspC的调控目标，并揭示了CspC响应宿主体内环境变化的调控机制。CspC进入宿主后乙酰化修饰丰度增加，减弱了CspC对于三型分泌系统基因的翻译抑制作用，进而增强了铜绿假单胞菌的毒力。
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